pBR322 es un plásmido y fue uno de los primeros vectores de clonación de E. coli ampliamente utilizados . Creado en 1977 en el laboratorio de Herbert Boyer en la Universidad de California, San Francisco , recibió su nombre de Francisco Bolívar Zapata , investigador postdoctoral y Raymond L. Rodríguez . La p significa "plásmido" y BR significa "Bolívar" y "Rodríguez".
pBR322 tiene 4361 pares de bases de longitud [1] y tiene dos genes de resistencia a antibióticos: el gen bla que codifica la proteína de resistencia a ampicilina (Amp R ) y el gen tetA que codifica la proteína de resistencia a tetraciclina (Tet R ). Contiene el origen de replicación de pMB1 y el gen rop , que codifica un restrictor del número de copias del plásmido. El plásmido tiene sitios de restricción únicos para más de cuarenta enzimas de restricción . Once de estos cuarenta sitios se encuentran dentro del Tet Rgene. Hay dos sitios para enzimas de restricción HindIII y ClaI dentro del promotor de la Tet R gen. Hay seis sitios de restricción clave dentro del gen Amp R. [2]
La secuencia circular está numerada de tal manera que 0 es el centro del sitio EcoRI único y el recuento se incrementa a través de la Tet R gen. El gen Amp R es la penicilina beta-lactamasa . Los promotores P1 y P3 son para el gen de la beta-lactamasa. P3 es el promotor natural y P1 se crea artificialmente mediante la unión de dos fragmentos de ADN diferentes para crear pBR322. P2 está en la misma región que P1, pero está en la hebra opuesta e inicia la transcripción en la dirección del gen de resistencia a la tetraciclina. [3]
Fondo
Los primeros experimentos de clonación pueden realizarse utilizando plásmidos naturales como ColE1 y pSC101 . Cada uno de estos plásmidos puede tener sus ventajas y desventajas. Por ejemplo, el plásmido ColE1 y sus derivados tienen la ventaja de un mayor número de copias y permiten la amplificación del plásmido con cloranfenicol para producir un alto rendimiento de plásmido, sin embargo, la detección de inmunidad a la colicina E1 no es técnicamente simple. [4] El plásmido pSC101, un plásmido natural de Salmonella panama , [5] confiere resistencia a la tetraciclina que permite un proceso de cribado más simple con selección de antibióticos, pero es un plásmido de bajo número de copias que no da un alto rendimiento de plásmido. Otro plásmido, RSF 2124, que es un derivado de ColE1, confiere resistencia a ampicilina pero es más grande.
Muchos otros plásmidos se construyeron artificialmente para crear uno que sería ideal para fines de clonación, y muchos encontraron que pBR322 era el más versátil y, por lo tanto, el más utilizado. [4] Tiene dos genes de resistencia a los antibióticos, como marcadores seleccionables , y varios sitios de restricción únicos y convenientes que lo hicieron adecuado como vector de clonación . El plásmido se construyó con material genético de 3 fuentes principales: el gen de resistencia a la tetraciclina de pSC101, el gen de resistencia a la ampicilina de RSF 2124 y los elementos de replicación de pMB1, un pariente cercano del plásmido ColE1 . [6] [7]
Desde entonces, se han construido un gran número de otros plásmidos basados en pBR322 diseñados específicamente para una amplia variedad de propósitos. [8] [9] Los ejemplos incluyen la serie pUC de plásmidos. [10] La mayoría de los vectores de expresión para la expresión de proteínas extracromosómicas y los vectores lanzadera contienen el origen de replicación pBR322, y los fragmentos de pBR322 son muy populares en la construcción de vectores lanzadera o binarios intraespecies y vectores para la integración dirigida y la escisión del ADN del cromosoma. [11]
Secuencia de ADN
La secuencia en pBR322 es [3]
pBR322 1 ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaappa 61 ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg 121 caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt 181 gcgggatatc gtccattccg acagcatcgc cagtcactat ggcgtgctgc tagcgctata 241 tgcgttgatg caatttctat gcgcacccgt tctcggagca ctgtccgacc gctttggccg 301 ccgcccagtc ctgctcgctt cgctacttgg agccactatc gactacgcga tcatggcgac 361 cacacccgtc ctgtggatcc tctacgccgg acgcatcgtg gccggcatca ccggcgccac 421 aggtgcggtt gctggcgcct atatcgccga catcaccgat ggggaagatc gggctcgcca 481 cttcgggctc atgagcgctt gtttcggcgt gggtatggtg gcaggccccg tggccggggg 541 actgttgggc gccatctcct tgcatgcacc attccttgcg gcggcggtgc tcaacggcct 601 caacctacta ctgggctgct tcctaatgca ggagtcgcat aagggagagc gtcgaccgat 661 gcccttgaga gccttcaacc cagtcagctc cttccggtgg gcgcggggca tgactatcgt 721 cgccgcactt atgactgtct tctttatcat gcaactcgta ggacaggtgc cggcagcgct 781 ctgggtcatt ttcggcgagg accgctttcg ctggagcgcg acgatgatcg gcctgtcgct 841 tgcggtattc 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Ver también
- Lista de sitios de corte de enzimas de restricción
Referencias
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enlaces externos
- pBR322 Mapa
- Características del pBR322
- ADN de pBR322