En genética , el ADN complementario ( ADNc ) es ADN sintetizado a partir de una plantilla de ARN monocatenario (p. ej., ARN mensajero ( ARNm ) o microARN (miARN)) en una reacción catalizada por la enzima transcriptasa inversa . El ADNc se utiliza a menudo para clonar genes eucariotas en procariotas . Cuando los científicos quieren expresar una proteína específica en una célula que normalmente no expresa esa proteína (es decir, heterólogaexpresión), transferirán el cDNA que codifica para la proteína a la célula receptora. En biología molecular, el ADNc también se genera para analizar perfiles transcriptómicos en tejido a granel, células individuales o núcleos individuales en ensayos como micromatrices y RNA-seq .
Los retrovirus (como el VIH-1 , el VIH-2 , el virus de la inmunodeficiencia de los simios , etc.) también producen ADNc de forma natural y luego se integran en el genoma del huésped, donde se crea un provirus . [1]
El término ADNc también se utiliza, típicamente en un contexto bioinformático , para referirse a la secuencia de un transcrito de ARNm, expresada como bases de ADN (desoxi-GCAT) en lugar de bases de ARN (GCAU).
El ARN sirve como molde para la síntesis de ADNc. [2] En la vida celular, el ADNc es generado por virus y retrotransposones para la integración del ARN en el ADN genómico objetivo . En biología molecular, el ARN se purifica del material de origen después de eliminar el ADN genómico, las proteínas y otros componentes celulares. El cDNA luego se sintetiza a través de la transcripción inversa in vitro . [3]
El ARN se transcribe a partir del ADN genómico en las células huésped y se extrae al lisar primero las células y luego purificar el ARN utilizando métodos ampliamente utilizados, como fenol-cloroformo, columna de sílice y métodos de extracción de ARN basados en perlas. [4] Los métodos de extracción varían según el material de origen. Por ejemplo, la extracción de ARN de tejido vegetal requiere reactivos adicionales, como polivinilpirrolidona (PVP), para eliminar compuestos fenólicos, carbohidratos y otros compuestos que, de lo contrario, inutilizarían el ARN. [5] Para eliminar el ADN y las proteínas, se utilizan enzimas como la ADNasa y la Proteinasa K para la degradación. [6]Es importante destacar que la integridad del ARN se mantiene mediante la inactivación de las ARNasas con agentes caotrópicos como el isotiocianato de guanidinio, el dodecilsulfato de sodio (SDS), el fenol o el cloroformo. Luego, el ARN total se separa de otros componentes celulares y se precipita con alcohol. Existen varios kits comerciales para extracciones de ARN simples y rápidas para aplicaciones específicas. [7] Se pueden usar métodos adicionales basados en perlas para aislar subtipos específicos de ARN (p. ej., ARNm y microARN ) según el tamaño o las regiones de ARN únicas. [8] [9]
Utilizando una enzima transcriptasa inversa y moldes de ARN purificados, se produce una cadena de ADNc (síntesis de ADNc de la primera cadena). La transcriptasa inversa M-MLV del virus de la leucemia murina de Moloney se usa comúnmente debido a su actividad reducida de RNasa H adecuada para la transcripción de ARN más largos. [10] La transcriptasa inversa AMV del virus de la mieloblastosis aviar también puede usarse para moldes de ARN con estructuras secundarias fuertes (es decir, alta temperatura de fusión). [11] El ADNc suele generarse a partir de ARNm para análisis de expresión génica, como RT-qPCR y RNA-seq . [12] El ARNm se transcribe inversamente de forma selectiva utilizando oligo-d Tcebadores que son el complemento inverso de la cola poliadenilada en el extremo 3' de todo el ARNm. Una mezcla optimizada de oligo-dT y cebadores de hexámeros aleatorios aumenta la posibilidad de obtener ADNc de longitud completa al tiempo que reduce el sesgo 5' o 3'. [13] El ARN ribosómico también se puede agotar para enriquecer tanto el ARNm como los transcritos no poliadenilados, como algunos ARN no codificantes . [14]