La síntesis de proteínas sin células , también conocida como síntesis de proteínas in vitro o CFPS , es la producción de proteínas utilizando maquinaria biológica en un sistema libre de células , es decir, sin el uso de células vivas . El entorno de síntesis de proteínas in vitro no está limitado por la pared celular o las condiciones de homeostasis necesarias para mantener la viabilidad celular. [1] Así, CFPS permite el acceso directo y el control de la traducción.entorno que es ventajoso para una serie de aplicaciones, incluida la solubilización cotraduccional de proteínas de membrana, la optimización de la producción de proteínas, la incorporación de aminoácidos no naturales, el marcaje selectivo y específico del sitio. [2] [3] Debido a la naturaleza abierta del sistema, se pueden seleccionar diferentes condiciones de expresión como pH, potenciales redox , temperaturas y acompañantes . Dado que no es necesario mantener la viabilidad celular, se pueden producir proteínas tóxicas.
Introducción
Los componentes comunes de una reacción libre de células incluyen un extracto celular, una fuente de energía, un suministro de aminoácidos , cofactores como el magnesio y el ADN con los genes deseados . Se obtiene un extracto celular al lisar la célula de interés y centrifugar las paredes celulares, el genoma del ADN y otros desechos. Los restos son la maquinaria celular necesaria que incluye ribosomas , aminoacil-tRNA sintetasas , factores de iniciación y elongación de la traducción , nucleasas , etc.
Se pueden usar dos tipos de ADN en CFPS: plásmidos y plantillas de expresión lineal (LET). Los plásmidos son circulares y solo se forman dentro de las células. Los LET se pueden producir de manera mucho más efectiva a través de la PCR , que replica el ADN mucho más rápido que la producción de células en una incubadora . Si bien los LET son más fáciles y rápidos de hacer, los rendimientos de plásmidos suelen ser mucho más altos en CFPS. Debido a esto, gran parte de la investigación actual se centra en optimizar los rendimientos de CFPS LET para aproximarse a los rendimientos de CFPS con plásmidos.
Una fuente de energía es una parte importante de una reacción libre de células. Por lo general, se agrega al extracto para la reacción una mezcla separada que contiene la fuente de energía necesaria, junto con un suministro de aminoácidos. Las fuentes comunes son piruvato de fosfoenol , fosfato de acetilo y fosfato de creatina .
Ventajas y aplicaciones
CFPS tiene muchas ventajas sobre la síntesis tradicional de proteínas in vivo . En particular, una reacción libre de células, incluida la preparación del extracto, suele tardar entre 1 y 2 días, mientras que la expresión de proteínas in vivo puede tardar entre 1 y 2 semanas. [4] [5] [6] [7]
CFPS es una reacción abierta. La falta de pared celular permite la manipulación directa del entorno químico. Se toman muestras fácilmente, se optimizan las concentraciones y se puede controlar la reacción. Por el contrario, una vez que se inserta el ADN en las células vivas, no se puede acceder a la reacción hasta que finaliza y las células se lisan.
Otra ventaja de CFPS es la falta de preocupación por la toxicidad. Algunas proteínas deseadas y proteínas marcadas son tóxicas para las células cuando se sintetizan. [8] Dado que no se utilizan células vivas, la toxicidad de la proteína del producto no es una preocupación importante.
Estas ventajas permiten numerosas aplicaciones. [9] [1] Una aplicación importante de CFPS es la incorporación de aminoácidos no naturales en estructuras de proteínas (ver código genético ampliado ). La apertura de la reacción es ideal para insertar los ARNt modificados y los aminoácidos no naturales necesarios para dicha reacción.
La biología sintética tiene muchos otros usos y es un futuro brillante en campos como la evolución de proteínas , nanomáquinas , circuitos de ácido nucleico y síntesis de partículas similares a virus para vacunas y farmacoterapia . [10] [11] [12]
Limitaciones
Un desafío asociado con CFPS es la degradación del ADN por nucleasas endógenas en el extracto celular. Esto es particularmente problemático con las LET. Las células tienen endonucleasas que atacan sitios aleatorios de cadenas de ADN; sin embargo, son mucho más comunes las exonucleasas que atacan al ADN desde los extremos. Dado que los plásmidos son circulares y no tienen un extremo al que puedan unirse las exonucleasas, estas últimas no los afectan. Los LET, sin embargo, son susceptibles a ambos. Debido a la vulnerabilidad de LET, mucha investigación actual se centra en optimizar los rendimientos de CFPS LET para acercarse a los rendimientos de CFPS utilizando plásmidos.
Un ejemplo de esta protección mejorada con plásmidos es el uso de la proteína gam del bacteriófago lambda . [13] Gam es un inhibidor de RecBCD , una exonucleasa que se encuentra en Escherichia coli ( E. coli ). [14] Con el uso de gam, los rendimientos de CFPS con LET aumentaron considerablemente y fueron comparables a los rendimientos de CFPS con plásmidos. [15] También se pueden hacer extractos PUROS, eliminando la preocupación por las exonucleasas. Estos extractos son costosos de fabricar y actualmente no son una solución económica al problema de la degradación exógena del ADN.
Tipos de sistemas sin células
Los extractos de células comunes que se utilizan hoy en día están hechos de E. coli (ECE), reticulocitos de conejo (RRL), germen de trigo (WGE), células de insectos (ICE) y levadura Kluyveromyces ( el sistema D2P ). [1] [5] Todos estos extractos están disponibles comercialmente.
ECE es el lisado más popular por varias razones. Es el extracto más económico y el que requiere menos tiempo para su creación. Además, se cultivan fácilmente grandes cantidades de E. coli y luego se lisan fácilmente mediante el uso de un homogeneizador o un sonicador . [1] ECE también proporciona los mayores rendimientos de proteínas. Sin embargo, la producción de alto rendimiento puede limitar la complejidad de la proteína sintetizada, particularmente en la modificación postraduccional . En ese sentido, los sistemas eucariotas de menor eficacia podrían ser ventajosos, siempre que se hayan mantenido en los extractos sistemas enzimáticos modificadores .
Cada sistema eucariota tiene sus ventajas y desventajas. Por ejemplo, el extracto de WGE produce los rendimientos más altos de los tres extractos eucariotas; sin embargo, no es tan eficaz para algunas modificaciones postraduccionales como la glicosilación . [5] Al elegir un extracto, se deben tener en cuenta el tipo de modificación postraduccional, los rendimientos deseados y el costo.
Historia
La síntesis de proteínas sin células se ha utilizado durante más de 60 años y, en particular, la primera elucidación de un codón fue realizada por Marshall Nirenberg y Heinrich J. Matthaei en 1961 en los Institutos Nacionales de Salud. [1] [16] Utilizaron un sistema libre de células para traducir una secuencia de ARN de poli- uracilo (o UUUUU ... en términos bioquímicos ) y descubrieron que el polipéptido que habían sintetizado consistía únicamente en el aminoácido fenilalanina . De este modo dedujeron de esta polifenilalanina que el codón UUU especificaba el aminoácido fenilalanina. Ampliando este trabajo, Nirenberg y sus compañeros de trabajo pudieron determinar la composición de nucleótidos de cada codón.
Ver también
- Experimento de Nirenberg y Matthaei
- Optimización de la reacción en cadena de la polimerasa
Referencias
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Otras lecturas
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