La disrupción celular es un método o proceso para liberar moléculas biológicas desde el interior de una célula .
Métodos
La producción de moléculas de interés biológico mediante métodos de clonación y cultivo permite el estudio y la fabricación de moléculas relevantes. A excepción de las moléculas excretadas, las células que producen moléculas de interés deben romperse. Esta página analiza varios métodos. Otro método de interrupción se llama destecho de celdas .
Método de cuentas
Un método mecánico común a escala de laboratorio para la rotura celular utiliza perlas de vidrio, cerámica o acero, de 0,1 a 2 mm de diámetro, mezcladas con una muestra suspendida en un medio acuoso. Desarrollado por primera vez por Tim Hopkins a fines de la década de 1970, la mezcla de muestra y perlas se somete a una agitación de alto nivel mediante agitación o agitación. Las perlas chocan con la muestra celular, abriendo la célula para liberar componentes intercelulares. A diferencia de otros métodos, el cizallamiento mecánico es moderado durante la homogeneización, lo que da como resultado excelentes preparaciones de membrana o subcelulares. El método, a menudo llamado "batido de cuentas", funciona bien para todo tipo de material celular, desde esporas hasta tejidos animales y vegetales. Es el método de lisis de levadura más utilizado y puede producir una rotura de más del 50% (hasta el 95%). [1] Tiene la ventaja sobre otros métodos mecánicos de alteración celular de poder alterar tamaños de muestra muy pequeños, procesar muchas muestras a la vez sin preocupaciones de contaminación cruzada y no libera aerosoles potencialmente dañinos en el proceso.
En el ejemplo más simple del método, se agrega un volumen igual de perlas a una suspensión de células o tejidos en un tubo de ensayo y la muestra se mezcla vigorosamente en un mezclador de vórtice de laboratorio común. Si bien los tiempos de procesamiento son lentos, demorando de 3 a 10 veces más que en las máquinas de agitación especiales, funciona bien para las células que se rompen fácilmente y es económico.
El éxito del batido de perlas depende no solo de las características de diseño de la máquina de agitación (que tienen en cuenta las oscilaciones de agitación por minuto, el alcance o la distancia de agitación, la orientación de agitación y la orientación del vial), sino también la selección del tamaño de perla correcto (0,1 a 6 mm de diámetro), composición de perlas (vidrio, cerámica, acero) y carga de perlas en el vial.
En la mayoría de los laboratorios, el batido de perlas se realiza en lotes de uno a veinticuatro viales de plástico sellados o tubos de centrífuga. La muestra y las microesferas se agitan a unas 2000 oscilaciones por minuto en agitadores alternativos especialmente diseñados impulsados por motores eléctricos de alta potencia. La alteración celular se completa en 1 a 3 minutos de agitación. Se logran tasas significativamente más rápidas de ruptura celular con una variación de beadbeater llamada SoniBeast. A diferencia de las máquinas convencionales, agita las perlas mediante un movimiento de vórtice a 20.000 oscl / min. Las máquinas batidoras de perlas más grandes que sostienen placas de microtitulación de pozos profundos también acortan los tiempos de proceso, al igual que los dispensadores de perlas diseñados para cargar perlas rápidamente en varios viales o microplacas. [2] [3] También se encuentran disponibles microplacas y viales precargados.
Todas las máquinas batidoras de perlas de alta energía calientan la muestra a unos 10 grados / minuto. Esto se debe a las colisiones por fricción de las perlas durante la homogeneización. Puede ser necesario enfriar la muestra durante o después del batido de perlas para evitar daños en las proteínas sensibles al calor, como las enzimas. El calentamiento de la muestra se puede controlar batiendo las perlas durante cortos intervalos de tiempo con enfriamiento en hielo entre cada intervalo, procesando los viales en soportes de aluminio para viales preenfriados o haciendo circular refrigerante gaseoso a través de la máquina durante el batido de las perlas.
Una configuración diferente del batidor de perlas, adecuada para volúmenes de muestra más grandes, utiliza un rotor de fluorocarbono giratorio dentro de una cámara de 15, 50 o 200 ml para agitar las perlas. En esta configuración, la cámara puede estar rodeada por una camisa de refrigeración estática. Con esta misma configuración de rotor / cámara, se encuentran disponibles grandes máquinas comerciales para procesar muchos litros de suspensión celular . Actualmente, estas máquinas se limitan a procesar organismos monocelulares como levaduras, algas y bacterias.
Criopulverización
Las muestras con una matriz extracelular resistente, como tejido conectivo animal, algunas muestras de biopsias de tumores, tejido venoso, cartílago, semillas, etc., se reducen a un polvo fino mediante pulverización por impacto a temperaturas de nitrógeno líquido. Esta técnica, conocida como criopulverización, se basa en el hecho de que las muestras biológicas que contienen una fracción importante de agua se vuelven quebradizas a temperaturas extremadamente frías. Esta técnica fue descrita por primera vez por Smucker y Pfister en 1975, quienes se refirieron a la técnica como crioimpacto. Los autores demostraron que las células se rompen de manera efectiva con este método, lo que confirma mediante microscopía electrónica y de fase que los planos de ruptura atraviesan las paredes celulares y las membranas citoplasmáticas. [4]
La técnica se puede realizar utilizando un mortero enfriado a temperaturas de nitrógeno líquido, pero el uso de este aparato clásico es laborioso y la pérdida de muestras suele ser una preocupación. Los pulverizadores de acero inoxidable especializados conocidos genéricamente como pulverizadores de tejidos también están disponibles para este propósito. Requieren menos esfuerzo manual, brindan una buena recuperación de muestras y son fáciles de limpiar entre muestras. Las ventajas de esta técnica son los mayores rendimientos de proteínas y ácidos nucleicos de muestras pequeñas de tejido duro, especialmente cuando se utiliza como paso preliminar a los métodos de disrupción celular mecánicos o químicos / solventes mencionados anteriormente.
Interrupción de la celda de alta presión
Desde la década de 1940, la alta presión se ha utilizado como método de ruptura celular, sobre todo por la French Pressure Cell Press , o French Press para abreviar. Este método fue desarrollado por Charles Stacy French y utiliza alta presión para forzar a las células a pasar a través de un orificio estrecho, lo que hace que las células se lisen debido a las fuerzas de corte experimentadas a través del diferencial de presión. [5] [6] Si bien las prensas francesas se han convertido en un elemento básico en muchos laboratorios de microbiología, su producción se ha interrumpido en gran medida, lo que ha provocado un resurgimiento de aplicaciones alternativas de tecnología similar.
Los disruptores celulares físicos modernos generalmente operan a través de presión neumática o hidráulica. Aunque las máquinas neumáticas son típicamente de menor costo, su desempeño puede ser poco confiable debido a las variaciones en la presión de procesamiento a lo largo de la carrera de la bomba de aire. En general, se considera que las máquinas hidráulicas ofrecen una capacidad de lisado superior, especialmente cuando se procesan muestras más difíciles de romper, como levaduras o bacterias Gram positivas , debido a su capacidad para mantener una presión constante durante toda la carrera del pistón. Como la prensa francesa, que funciona con presión hidráulica, es capaz de lisar más del 90% de los tipos de células más comúnmente utilizados, a menudo se la considera el estándar de oro en el rendimiento de la lisis y las máquinas modernas a menudo se comparan con ella no solo en términos de lisis. eficiencia, sino también en términos de seguridad y facilidad de uso. Algunos fabricantes también están tratando de mejorar el diseño tradicional alterando las propiedades dentro de estas máquinas además de la presión que impulsa la muestra a través del orificio. Un ejemplo de ello es Constant Systems, que recientemente ha demostrado que sus disruptores celulares no solo igualan el rendimiento de una prensa francesa tradicional, sino que también se esfuerzan por lograr los mismos resultados a una potencia mucho menor. [7]
Tecnología de ciclos de presión ("PCT"). PCT es una plataforma tecnológica patentada que utiliza ciclos alternos de presión hidrostática entre niveles ambientales y ultra altos (hasta 90,000 psi) para controlar de manera segura, conveniente y reproducible las acciones de las moléculas en muestras biológicas, por ejemplo, la ruptura (lisis) de células y tejidos de fuentes humanas, animales, vegetales y microbianas, y la inactivación de patógenos. Los sistemas mejorados con PCT (instrumentos y consumibles) abordan algunos problemas desafiantes inherentes a la preparación de muestras biológicas. Las ventajas de la PCT incluyen: (a) extracción y recuperación de más proteínas de membrana, (b) digestión mejorada de proteínas, (c) lisis diferencial en una base de muestra mixta, (d) inactivación de patógenos, (e) mayor detección de ADN, y (f) exquisito control del proceso de preparación de muestras. [8]
El método del microfluidizador utilizado para la disrupción celular influye fuertemente en las propiedades fisicoquímicas de la suspensión celular lisada , como el tamaño de partícula, la viscosidad, el rendimiento de proteínas y la actividad enzimática. En los últimos años, el método Microfluidizer ha ganado popularidad en la alteración celular debido a su facilidad de uso y eficiencia para alterar muchos tipos diferentes de células. La tecnología Microfluidizer obtuvo la licencia de una empresa llamada Arthur D. Little y se desarrolló y utilizó por primera vez en la década de 1980, comenzando inicialmente como una herramienta para la creación de liposomas . Desde entonces, se ha utilizado en otras aplicaciones, como nanoemulsiones de disrupción celular y reducción del tamaño de partículas sólidas, entre otras.
Mediante el uso de microcanales con geometría fija y una bomba intensificadora, se generan altas tasas de cizallamiento que rompen las células. Este método de lisis celular puede producir la rotura de más del 90% de las células de E. coli. [9]
Muchas proteínas son extremadamente sensibles a la temperatura y, en muchos casos, pueden comenzar a desnaturalizarse a temperaturas de solo 4 grados centígrados. Dentro de los microcanales, las temperaturas superan los 4 grados centígrados, pero la máquina está diseñada para enfriarse rápidamente, de modo que el tiempo de exposición de las células a temperaturas elevadas es extremadamente corto ( tiempo de residencia 25 ms-40 ms). Debido a este control eficaz de la temperatura, el microfluidizador produce niveles más altos de proteínas y enzimas activas que otros métodos mecánicos cuando las proteínas son sensibles a la temperatura. [10]
Los cambios de viscosidad también se observan a menudo al romper las células. Si la viscosidad de la suspensión celular es alta, puede dificultar bastante el manejo posterior, como la filtración y el pipeteo preciso. Los cambios de viscosidad observados con un microfluidizador son relativamente bajos y disminuyen con más pasadas adicionales a través de la máquina. [11]
A diferencia de otros métodos de ruptura mecánica, el microfluidizador rompe las membranas celulares de manera eficiente pero suave, lo que da como resultado fragmentos de pared celular relativamente grandes (450 nm) y, por lo tanto, facilita la separación del contenido celular. Esto puede conducir a tiempos de filtración más cortos y una mejor separación por centrifugación. [12]
La tecnología de microfluidizadores se escala de un mililitro a miles de litros.
Descompresión de nitrógeno
Para la descompresión de nitrógeno, primero se disuelven grandes cantidades de nitrógeno en la celda a alta presión dentro de un recipiente a presión adecuado . Luego, cuando la presión del gas se libera repentinamente, el nitrógeno sale de la solución como burbujas en expansión que estiran las membranas de cada celda hasta que se rompen y liberan el contenido de la celda.
La descompresión de nitrógeno protege más las enzimas y los orgánulos que los métodos de homogeneización ultrasónica y mecánica y se compara favorablemente con la acción disruptiva controlada obtenida en un homogeneizador de mortero y mortero de PTFE y vidrio. [13] Mientras que otros métodos disruptivos dependen de la fricción o de una acción de cizallamiento mecánico que genera calor, el procedimiento de descompresión de nitrógeno se acompaña de una expansión adiabática que enfría la muestra en lugar de calentarla.
El manto de gas nitrógeno inerte que satura la suspensión celular y el homogeneizado ofrece protección contra la oxidación de los componentes celulares. Aunque en esta técnica se han utilizado otros gases: dióxido de carbono , óxido nitroso , monóxido de carbono y aire comprimido, se prefiere el nitrógeno por su naturaleza no reactiva y porque no altera el pH del medio de suspensión. Además, se prefiere el nitrógeno porque generalmente está disponible a bajo costo y a presiones adecuadas para este procedimiento.
Una vez liberadas, las sustancias subcelulares no están expuestas a un desgaste continuo que pueda desnaturalizar la muestra o producir daños no deseados. No es necesario estar atento a un pico entre la actividad enzimática y el porcentaje de interrupción. Dado que se generan burbujas de nitrógeno dentro de cada celda, la misma fuerza disruptiva se aplica uniformemente en toda la muestra, asegurando así una uniformidad inusual en el producto. Se pueden producir homogeneizados sin células.
La técnica se utiliza para homogeneizar células y tejidos, liberar orgánulos intactos , preparar membranas celulares , liberar bioquímicos lábiles y producir homogeneizados uniformes y repetibles sin someter la muestra a un estrés químico o físico extremo.
El método es particularmente adecuado para tratar células de mamíferos y otras células unidas a membranas. [14] También se ha utilizado con éxito para tratar células vegetales , liberar virus de huevos fertilizados y tratar bacterias frágiles . No se recomienda para células bacterianas no tratadas. Las levaduras , hongos , esporas y otros materiales con paredes celulares resistentes no responden bien a este método.
Ver también
- Homogeneizador ultrasónico
- Sonicación
- Homogeneización (química)
- Homogeneizador
Referencias
- ^ EMBL - Oficina de información y asuntos públicos. "Purificación de proteínas" . embl.de . Consultado el 19 de mayo de 2015 . CS1 maint: parámetro desalentado ( enlace )
- ^ "Copia archivada" . Archivado desde el original el 25 de abril de 2017 . Consultado el 24 de abril de 2017 .Mantenimiento de CS1: copia archivada como título ( enlace )
- ^ https://www.biospec.com/category/bead-loaders
- ^ Impacto criogénico de nitrógeno líquido: un nuevo concepto de disrupción celular. Richard A. Smucker, Robert M. Pfister. Appl Microbiol. Septiembre de 1975; 30 (3): 445–449.
- ^ La actividad fotoquímica de los cloroplastos aislados. CS French, HW Milner, ML Koenig y FDH Macdowall. Carn. Inst. Wash. Añob. 1948; 47: 91-93
- ^ El proceso de reducción fotoquímica en la fotosíntesis. En Simposios de la Sociedad de Biología Experimental. CS French, HW Milner. V. Fijación de dióxido de carbono y fotosíntesis. 232-250. Cambridge University Press, Nueva York.
- ^ Bajo presión, M. Lougher, European Bipharmaceutical Review, julio de 2016; 12-16
- ^ http://www.pressurebiosciences.com/documents?task=document.viewdoc&id=64
- ^ Evaluación del microfluidizador para la alteración celular de levadura y Chlorella por E. Uera-Santos, CD Copple, EA Davis y WG. Agar.
- ^ agerkvist, Irene y Sven-Olof Enfors. ”Caracterización de la célula de E. Coli se desintegra a partir de un Bead Bill y un homogeneizador de alta presión”. Biotecnología y bioingeniería Biotechnol.Bioeng.36.11 (1990): 1083-089.Web.
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- ^ "Parr Instruments - Vaso de interrupción celular, volumen interno de 1 galón - John Morris" . www.johnmorrisgroup.com . Consultado el 13 de diciembre de 2019 .
- ^ "Aplicaciones" . Parr Instrument Company . Consultado el 13 de diciembre de 2019 .