quimioproteómica

La quimioproteómica implica una amplia gama de técnicas utilizadas para identificar e interrogar las interacciones entre proteínas y moléculas pequeñas . La quimioproteómica complementa el descubrimiento de fármacos fenotípicos , un paradigma que tiene como objetivo descubrir compuestos principales sobre la base de aliviar el fenotipo de una enfermedad , a diferencia del descubrimiento de fármacos basado en objetivos (farmacología inversa) , en el que los compuestos principales están diseñados para interactuar con agentes biológicos predeterminados que provocan enfermedades. objetivos _ [1] Dado que los ensayos de descubrimiento de fármacos fenotípicos no proporcionan confirmación del mecanismo de acción de un compuesto, la quimioproteómica proporciona valiosas estrategias de seguimiento para reducir los objetivos potenciales y finalmente validar el mecanismo de acción de una molécula . [1] La quimioproteómica también intenta abordar el desafío inherente de la promiscuidad de fármacos en el descubrimiento de fármacos de molécula pequeña mediante el análisis de las interacciones proteína-molécula pequeña en una escala amplia del proteoma . Un objetivo principal de la quimioproteómica es caracterizar el interactoma de los candidatos a fármacos para obtener información sobre los mecanismos de toxicidad fuera del objetivo y la polifarmacología . [2]

Los ensayos de quimioproteómica se pueden estratificar en tres tipos básicos. Los enfoques basados ​​en soluciones implican el uso de análogos de fármacos que modifican químicamente las proteínas diana en solución , marcándolas para su identificación. Los enfoques basados ​​en la inmovilización buscan aislar objetivos o ligandos potenciales anclando a sus socios de unión a un soporte inmóvil. Los enfoques sin derivatización tienen como objetivo inferir las interacciones entre el fármaco y el objetivo mediante la observación de cambios en la estabilidad de la proteína o la cromatografía del fármaco tras la unión. Las técnicas computacionales complementan el conjunto de herramientas de quimioproteómica como líneas paralelas de evidencia que respaldan el potencialpares de fármaco - objetivo , y se utilizan para generar modelos estructurales que informan la optimización de prospectos . Se han identificado varios objetivos de fármacos de alto perfil utilizando la quimioproteómica, y la mejora continua de la sensibilidad del espectrómetro de masas y la tecnología de sondas químicas indica que la quimioproteómica desempeñará un papel importante en el descubrimiento de fármacos en el futuro .

La conclusión del Proyecto Genoma Humano se siguió con la esperanza de un nuevo paradigma en el tratamiento de enfermedades. Muchas enfermedades fatales e intratables pudieron mapearse en genes específicos , proporcionando un punto de partida para comprender mejor el papel de sus productos proteicos en la enfermedad. El descubrimiento de fármacos ha hecho uso de modelos animales knock-out que resaltan el impacto de la ausencia de una proteína , particularmente en el desarrollo de enfermedades, y los químicos médicos han aprovechado la química computacional para generar compuestos de alta afinidad contra las proteínas que causan enfermedades. [2] Sin embargo, la FDA Las tasas de aprobación de medicamentos han disminuido durante la última década. [3] Una posible fuente de fracaso de los fármacos es la desconexión entre el descubrimiento temprano y tardío de fármacos . [2] El descubrimiento temprano de fármacos se enfoca en la validación genética de un objetivo, que es un fuerte predictor de éxito, pero los sistemas de eliminación y sobreexpresión son simplistas. Los sistemas knock-out / knock-in condicionales espacial y temporalmente han mejorado el nivel de matiz en el análisis in vivo de proteínasfunción, pero aún no logran un paralelismo completo con la amplitud sistémica de la acción farmacológica. [2] Por ejemplo, los medicamentos a menudo actúan a través de múltiples mecanismos y, a menudo, funcionan mejor si atacan parcialmente a los objetivos . [2] Las herramientas quimioproteómicas ofrecen una solución para cerrar la brecha entre la comprensión genética de la enfermedad y la comprensión farmacológica de la acción del fármaco al identificar las muchas proteínas involucradas en el éxito terapéutico.

Un ejemplo de flujo de trabajo de proteómica cuantitativa. Los extractos de proteínas de diferentes muestras se extraen y digieren utilizando tripsina . Las muestras separadas se etiquetan usando etiquetas de masa en tándem (TMT) isobáricas individuales, luego las muestras etiquetadas se agrupan. El origen de la muestra de cada péptido se puede discernir a partir de la TMT unida a él. A continuación, los péptidos marcados se detectan y fragmentan mediante LC-MS/MS y se cuantifican comparando las cantidades relativas de fragmentos de TMT en cada espectro de masas . Esta imagen fue adaptada de BioRender.com .
Una sonda prototípica de perfil de proteínas basada en la actividad . Una ojiva covalente y una etiqueta indicadora están conectadas por un grupo enlazador. La ojiva se une covalentemente con el sitio activo de una enzima y la etiqueta indicadora se usa para enriquecer o detectar la proteína marcada . El fluorofosfonato - biotina es un ejemplo de una sonda basada en la actividad que se dirige a las serina hidrolasas . Está conectado a un mango de enriquecimiento biotinilado por una cadena de alcano . Esta imagen fue hecha usando BioRender.com .
Una sonda de fotoafinidad prototípica. Un andamio de fármaco actúa como el primer sitio de interacción entre la sonda y la proteína. La luz puede activar un grupo fotorreactivo , aquí una arilazida , para formar un intermedio reactivo que se une a un sitio no específico de la proteína. Luego se puede usar una etiqueta para enriquecer e identificar o crear una imagen y detectar el objetivo. Esta imagen fue hecha usando BioRender.com .
Fenilazida, un grupo fotorreactivo comúnmente utilizado en el etiquetado de fotoafinidad.
Tres estrategias para la identificación de objetivos basada en la inmovilización. En todos los casos, las mezclas de proteínas se incuban con el ligando y los objetivos unidos se detectan aguas abajo. (1A) Los ligandos se unen a un soporte sólido, como una microperla o una columna de cromatografía , mediante derivatización . (1B) Los ligandos se unen a los objetivos en solución y luego son absorbidos por un controlador de enriquecimiento, como la biotina . (1C) Los ligandos contienen un entrecruzamientogrupo, que se activa, a menudo con luz, etiquetando el objetivo. Se utiliza un controlador de enriquecimiento para bajar el objetivo etiquetado . (2) Después de la unión, el objetivo se puede eluir del ligando o tripsinizar directamente en la perla. Los péptidos tripsinizados se analizan mediante LC-MS/MS . Esta imagen fue adaptada de BioRender.com .
Un ejemplo de flujo de trabajo de generación de perfiles de proteoma térmico. La unión de un fármaco a una proteína a menudo conduce a la estabilización de la proteína inducida por ligando (1), que se puede medir comparando la cantidad de proteína no desnaturalizada que queda en una muestra tratada con fármaco con un control no tratado. El cambio en la estabilidad de la proteína se puede visualizar como un desplazamiento hacia la derecha en su curva de estabilidad (2). Esta imagen fue adaptada de BioRender.com .
Un ejemplo de flujo de trabajo de estabilidad del objetivo sensible a la afinidad del fármaco (DARTS). La unión de un fármaco a una proteína a menudo conduce a la estabilización de la proteína inducida por ligando. En DARTS, las proteínas tratadas con el fármaco y el control se someten a una proteólisis limitada y el grado de digestión de las proteínas puede visualizarse en un gel o medirse mediante espectrometría de masas . Se espera que la unión del fármaco produzca un aumento en la señal de la proteína estabilizada. Esta imagen fue hecha usando BioRender.com .
Un ejemplo de flujo de trabajo de estabilidad de proteínas a partir de tasas de oxidación (SPROX). La unión de un fármaco a una proteína a menudo conduce a la estabilización de la proteína inducida por ligando. En SPROX, las muestras de proteínas tratadas con el fármaco y el control se exponen a cantidades cada vez mayores de un desnaturalizante . Se agrega peróxido de hidrógeno para oxidar los residuos de metionina expuestos . Se espera que la unión del fármaco proteja a la metionina de la oxidación al estabilizar la forma plegada de una proteína. La extensión de la oxidación puede controlarse mediante espectrometría de masas y usarse para generar curvas de estabilidad. Esta imagen fue hecha usando BioRender.com .
Selección por afinidad mediante filtración en gel. Se agrega un grupo de compuestos de prueba a una muestra de proteína, que se pasa a través de una columna de filtración de gel . Los compuestos unidos a proteínas se mueven alrededor de las perlas y salen de la columna rápidamente. Los compuestos no unidos son lo suficientemente pequeños para viajar a través de las perlas y tomar un camino más largo antes de la elución. Esta imagen fue hecha usando BioRender.com .
Un ejemplo de flujo de trabajo de identificación de objetivos por coelución cromatográfica (TICC). El lisado enriquecido con fármacos se fracciona mediante cromatografía de intercambio iónico . Las fracciones se recogen cada minuto y luego se analizan tanto para el contenido de fármaco como de proteína mediante LC-MS/MS. Los perfiles de elución de fármacos y proteínas se construyen y correlacionan. La identificación de objetivos está respaldada por una fuerte correlación en el perfil de elución entre un fármaco y una proteína. Esta imagen fue hecha usando BioRender.com .
Un modelo de farmacóforo de ejemplo. Cada esfera representa una característica puntuable diferente.
PROTAC: quimera dirigida a la proteólisis . Los PROTAC son pequeñas moléculas heterobifuncionales que contienen un grupo funcional que se une a un objetivo y otro grupo funcional que recluta una ubiquitina ligasa E3. La unión a ambas proteínas induce la ubiquitinación basada en la proximidad del objetivo por la ubiquitina ligasa E3, lo que conduce a la degradación del objetivo.