Las técnicas de captura de conformación cromosómica (a menudo abreviadas como tecnologías 3C o métodos basados en 3C [1] ) son un conjunto de métodos de biología molecular utilizados para analizar la organización espacial de la cromatina en una célula. Estos métodos cuantifican el número de interacciones entre los loci genómicos que están cerca en el espacio 3-D, pero pueden estar separados por muchos nucleótidos en el genoma lineal. [2] Estas interacciones pueden ser el resultado de funciones biológicas, como las interacciones promotor - potenciador , o de bucles de polímeros aleatorios, donde el movimiento físico no dirigido de la cromatina hace que los loci colisionen. [3]Las frecuencias de interacción pueden analizarse directamente [4] o pueden convertirse a distancias y usarse para reconstruir estructuras tridimensionales. [5]
La principal diferencia entre los métodos basados en 3C es su alcance. Por ejemplo, cuando se usa la PCR para detectar la interacción en un experimento 3C, se cuantifican las interacciones entre dos fragmentos específicos. Por el contrario, Hi-C cuantifica las interacciones entre todos los posibles pares de fragmentos simultáneamente. La secuenciación profunda del material producido por 3C también produce mapas de interacciones de todo el genoma.
Historia
Históricamente, la microscopía fue el método principal de investigación de la organización nuclear , [6] que se remonta a 1590. [7]
- En 1879, Walther Flemming acuñó el término cromatina. [8]
- En 1883, August Weismann relacionó la cromatina con la herencia.
- En 1884, Albrecht Kossel descubrió las histonas.
- En 1888, Sutton y Boveri propusieron la teoría de la continuidad de la cromatina durante el ciclo celular [9].
- En 1889, Wilhelm von Waldemeyer creó el término " cromosoma ". [10]
- En 1928, Emil Heitz acuñó el término heterocromatina y eucromatina . [11]
- En 1942, Conrad Waddington postuló los paisajes epigenéticos . [12]
- En 1948, Rollin Hotchkiss descubrió la metilación del ADN. [13]
- En 1953, Watson y Crick descubrieron la estructura de doble hélice del ADN. [14]
- En 1961, Mary Lyon postuló el principio de la X-inactivación .
- En 1973/1974, se descubrió la fibra de cromatina. [12]
- En 1975, Pierre Chambon acuñó el término nucleosomas . [12]
- En 1982, se descubrieron territorios cromosómicos . [15]
- En 1984, John T. Lis innovó la técnica de inmunoprecipitación de cromatina .
- En 1993, se publicó el Ensayo de ligadura nuclear, un método que podía determinar las frecuencias de circularización del ADN en solución. Este ensayo se utilizó para demostrar que el estrógeno induce una interacción entre el promotor del gen de la prolactina y un potenciador cercano . [dieciséis]
- En 2002, Job Dekker introdujo la nueva idea de que se podían utilizar matrices densas de frecuencias de interacción entre loci para inferir la organización espacial de los genomas. Esta idea fue la base para su desarrollo del ensayo de captura de conformación cromosómica (3C), publicado en 2002 por Job Dekker y sus colegas en el laboratorio Kleckner de la Universidad de Harvard . [17] [18]
- En 2003, se terminó el Proyecto Genoma Humano .
- En 2006, Marieke Simonis inventó 4C, [19] Dostie, en el laboratorio Dekker, inventó 5C. [20]
- En 2007, B. Franklin Pugh innovó la técnica ChIP-seq. [21]
- En 2009, Lieberman-Aiden y Job Dekker inventaron Hi-C, [22] Melissa J. Fullwood y Yijun Ruan inventaron ChIA-PET. [23]
- En 2012, el grupo The Ren y los grupos dirigidos por Edith Heard y Job Dekker descubrieron dominios de asociación topológica (TAD) en mamíferos. [24] [25]
- En 2013, Takashi Nagano y Peter Fraser introdujeron la ligadura en el núcleo para Hi-C y Hi-C unicelular. [26]
metodos experimentales
Todos los métodos 3C comienzan con un conjunto similar de pasos, realizados en una muestra de células.
En primer lugar, los genomas celulares se entrecruzan con formaldehído , [27] que introduce enlaces que "congelan" las interacciones entre los loci genómicos. El tratamiento de las células con formaldehído al 1-3%, durante 10-30 min a temperatura ambiente es más común, sin embargo, es necesaria la estandarización para prevenir el entrecruzamiento alto de proteína-ADN, ya que esto puede afectar negativamente la eficiencia de la digestión de restricción en el paso posterior. [28] Luego, el genoma se corta en fragmentos con una endonucleasa de restricción . El tamaño de los fragmentos de restricción determina la resolución del mapeo de interacción. Las enzimas de restricción (RE) que hacen cortes en las secuencias de reconocimiento de 6 pb, como EcoR1 o HindIII , se utilizan para este propósito, ya que cortan el genoma una vez cada 4000 pb, dando ~ 1 millón de fragmentos en el genoma humano. [28] [29] Para un mapeo de interacción más preciso, también se puede usar un RE de reconocimiento de 4 pb. El siguiente paso es la ligadura por proximidad . Esto tiene lugar a bajas concentraciones de ADN o dentro de núcleos intactos y permeabilizados [26] en presencia de ADN ligasa T4 , [30] de modo que se favorece la ligadura entre fragmentos que interactúan entrecruzados sobre la ligadura entre fragmentos que no están entrecruzados. Posteriormente, los loci que interactúan se cuantifican mediante la amplificación de uniones ligadas mediante métodos de PCR. [28] [30]
Métodos originales
3C (uno contra uno)
El experimento de captura de conformación cromosómica (3C) cuantifica las interacciones entre un solo par de loci genómicos. Por ejemplo, 3C puede usarse para probar una interacción promotor-potenciador candidata. Los fragmentos ligados se detectan mediante PCR con cebadores conocidos . [2] [17] Es por eso que esta técnica requiere el conocimiento previo de las regiones interactuantes.
4C (uno contra todos)
La captura en chip de conformación cromosómica (4C) captura interacciones entre un locus y todos los demás loci genómicos. Se trata de un segundo paso de ligadura, para crear fragmentos de ADN autocircularizados, que se utilizan para realizar la PCR inversa . La PCR inversa permite utilizar la secuencia conocida para amplificar la secuencia desconocida ligada a ella. [31] [2] [19] A diferencia de 3C y 5C, la técnica 4C no requiere el conocimiento previo de ambas regiones cromosómicas que interactúan. Los resultados obtenidos con 4C son altamente reproducibles con la mayoría de las interacciones que se detectan entre regiones próximas entre sí. En una sola micromatriz, se pueden analizar aproximadamente un millón de interacciones. [ cita requerida ]
5C (muchos contra muchos)
La copia de carbón de captura de conformación cromosómica (5C) detecta interacciones entre todos los fragmentos de restricción dentro de una región dada, con el tamaño de esta región típicamente no mayor que una megabase. [2] [20] Esto se hace ligando cebadores universales a todos los fragmentos. Sin embargo, 5C tiene una cobertura relativamente baja. La técnica 5C supera los problemas de unión en el paso de ligadura intramolecular y es útil para construir interacciones complejas de loci específicos de interés. Este enfoque no es adecuado para realizar interacciones complejas en todo el genoma, ya que para ello se necesitarán millones de cebadores 5C. [ cita requerida ]
Hola-C (todos contra todos)
Hi-C utiliza secuenciación de alto rendimiento para encontrar la secuencia de nucleótidos de los fragmentos [2] [22] y utiliza secuenciación de extremos emparejados , que recupera una secuencia corta de cada extremo de cada fragmento ligado. Como tal, para un fragmento ligado dado, las dos secuencias obtenidas deberían representar dos fragmentos de restricción diferentes que se ligaron juntos en la etapa de ligación basada en la proximidad. El par de secuencias se alinean individualmente con el genoma, determinando así los fragmentos involucrados en ese evento de ligación. Por tanto, se prueban todas las posibles interacciones por pares entre fragmentos.
Métodos basados en la captura de secuencias
Varios métodos utilizan la captura de oligonucleótidos para enriquecer bibliotecas de 3C y Hi-C para loci de interés específicos. [32] [33] Estos métodos incluyen Capture-C, [34] NG Capture-C, [35] Capture-3C, [34] HiCap, [32] [36] Capture Hi-C. [37] y Micro Capture-C. [38] Estos métodos pueden producir mayor resolución y sensibilidad que los métodos basados en 4C, [39] Micro Capture-C proporciona la resolución más alta de las técnicas 3C disponibles y es posible generar datos de resolución de pares de bases. [38]
Métodos unicelulares
Las adaptaciones unicelulares de estos métodos, como ChIP-seq y Hi-C, pueden usarse para investigar las interacciones que ocurren en células individuales. [40] [41]
Métodos basados en inmunoprecipitación
ChIP-loop
ChIP-loop combina 3C con ChIP-seq para detectar interacciones entre dos loci de interés mediadas por una proteína de interés. [2] [42] El bucle ChIP puede ser útil para identificar interacciones cis de largo alcance y la interacción trans mediada a través de proteínas, ya que no se producirán colisiones frecuentes de ADN. [ cita requerida ]
Métodos amplios del genoma
ChIA-PET combina Hi-C con ChIP-seq para detectar todas las interacciones mediadas por una proteína de interés. [2] [23] HiChIP fue diseñado para permitir un análisis similar al ChIA-PET con menos material de entrada. [43]
Impacto biológico
Los métodos 3C han dado lugar a una serie de conocimientos biológicos, incluido el descubrimiento de nuevas características estructurales de los cromosomas, la catalogación de los bucles de cromatina y una mayor comprensión de los mecanismos de regulación transcripcional (cuya interrupción puede conducir a una enfermedad). [6]
Los métodos 3C han demostrado la importancia de la proximidad espacial de los elementos reguladores a los genes que regulan. Por ejemplo, en tejidos que expresan genes de globina , la región de control del locus de β-globina forma un bucle con estos genes. Este bucle no se encuentra en tejidos donde no se expresa el gen. [44] Esta tecnología ha ayudado aún más al estudio genético y epigenético de los cromosomas tanto en organismos modelo como en humanos. [ no verificado en el cuerpo ]
Estos métodos han revelado una organización a gran escala del genoma en dominios de asociación topológica (TAD), que se correlacionan con marcadores epigenéticos. Algunos TAD son transcripcionalmente activos, mientras que otros están reprimidos. [45] Se han encontrado muchos TAD en D. melanogaster, ratón y humanos. [46] Además, el CTCF y la cohesina juegan un papel importante en la determinación de los TAD y las interacciones potenciador-promotor. El resultado muestra que la orientación de los motivos de unión de CTCF en un bucle potenciador-promotor debe estar enfrentada entre sí para que el potenciador encuentre su objetivo correcto. [47]
Enfermedad humana
Existen varias enfermedades causadas por defectos en las interacciones promotor-potenciador, que se revisan en este artículo. [48]
La beta talasemia es un cierto tipo de trastornos sanguíneos causados por una deleción del elemento potenciador de LCR. [49] [50]
La holoprosencefalia es un trastorno cefálico causado por una mutación en el elemento potenciador SBE2, que a su vez debilitó la producción del gen SHH. [51]
La PPD2 (polidactilia de un pulgar trifalángico) es causada por una mutación del potenciador de ZRS, que a su vez fortaleció la producción del gen SHH. [52] [53]
El adenocarcinoma de pulmón puede ser causado por una duplicación del elemento potenciador del gen MYC. [54]
La leucemia linfoblástica aguda de células T es causada por la introducción de un nuevo potenciador. [55]
Análisis de los datos
Los diferentes experimentos de estilo 3C producen datos con estructuras y propiedades estadísticas muy diferentes. Como tal, existen paquetes de análisis específicos para cada tipo de experimento. [33]
Los datos de Hi-C se utilizan a menudo para analizar la organización de la cromatina en todo el genoma, como los dominios de asociación topológica (TAD), regiones linealmente contiguas del genoma que están asociadas en el espacio 3-D. [45] Se han desarrollado varios algoritmos para identificar TAD a partir de datos Hi-C. [4] [60]
Hi-C y sus análisis posteriores están evolucionando. Fit-Hi-C [3] es un método basado en un enfoque de agrupamiento discreto con modificaciones para agregar distancia de interacción (ajuste de spline inicial, también conocido como spline-1) y refinar el modelo nulo (spline-2). El resultado de Fit-Hi-C es una lista de interacciones intracromosómicas por pares con sus valores p y valores q. [59]
La organización tridimensional del genoma también se puede analizar mediante la descomposición propia de la matriz de contacto. Cada vector propio corresponde a un conjunto de loci, que no son necesariamente contiguos linealmente, que comparten características estructurales. [61]
Un factor de confusión significativo en las tecnologías 3C son las frecuentes interacciones no específicas entre los loci genómicos que se producen debido al comportamiento aleatorio de los polímeros . Una interacción entre dos loci debe confirmarse como específica mediante pruebas de significación estadística. [3]
Normalización del mapa de contactos de Hi-C
Hay dos formas principales de normalizar los mapas de calor de contacto Hi-C sin procesar. La primera forma es asumir la misma visibilidad, lo que significa que existe la misma posibilidad de que cada posición cromosómica tenga una interacción. Por lo tanto, la verdadera señal de un mapa de contacto Hi-C debe ser una matriz balanceada (la matriz balanceada tiene sumas de filas y columnas constantes). Un ejemplo de algoritmos que asume la misma visibilidad es el algoritmo Sinkhorn-Knopp , que escala el mapa de contacto Hi-C sin procesar en una matriz equilibrada.
La otra forma es asumir que existe un sesgo asociado con cada posición cromosómica. El valor del mapa de contacto en cada coordenada será la verdadera señal en esa posición por el sesgo asociado con las dos posiciones de contacto. Un ejemplo de algoritmos que tienen como objetivo resolver este modelo de sesgo es la corrección iterativa, que retrocedió iterativamente el sesgo de fila y columna del mapa de contacto de Hi-C sin procesar. Hay una serie de herramientas de software disponibles para el análisis de datos de Hi-C. [62]
Análisis de motivos de ADN
Los motivos de ADN son secuencias de ADN cortas específicas, a menudo de 8 a 20 nucleótidos de longitud [63], que están sobrerrepresentadas estadísticamente en un conjunto de secuencias con una función biológica común. Actualmente, los motivos reguladores de las interacciones de cromatina de largo alcance no se han estudiado de forma exhaustiva. Varios estudios se han centrado en dilucidar el impacto de los motivos de ADN en las interacciones promotor-potenciador.
Bailey y col. ha identificado que el motivo ZNF143 en las regiones promotoras proporciona especificidad de secuencia para interacciones promotor-potenciador. [64] La mutación del motivo ZNF143 disminuyó la frecuencia de interacciones promotor-potenciador, lo que sugiere que ZNF143 es un nuevo factor de bucle de cromatina.
Para el análisis de motivos a escala del genoma, en 2016, Wong et al. informó una lista de 19491 pares de motivos de ADN para la línea celular K562 en las interacciones promotor-potenciador. [65] Como resultado, propusieron que la multiplicidad de emparejamiento de motivos (número de motivos que se emparejan con un motivo dado) está vinculada a la distancia de interacción y al tipo de región reguladora. Al año siguiente, Wong publicó otro artículo que informaba de 18.879 pares de motivos en 6 líneas celulares humanas. [66] Una contribución novedosa de este trabajo es MotifHyades, una herramienta de descubrimiento de motivos que se puede aplicar directamente a secuencias emparejadas.
Análisis del genoma del cáncer
Las técnicas basadas en 3C pueden proporcionar información sobre los reordenamientos cromosómicos en los genomas del cáncer. [67] Además, pueden mostrar cambios en la proximidad espacial de los elementos reguladores y sus genes diana, lo que aporta una comprensión más profunda de la base estructural y funcional del genoma. [68]
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Ver también
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