Inmunoprecipitación
La inmunoprecipitación ( IP ) es la técnica de precipitar un antígeno proteico de la solución utilizando un anticuerpo que se une específicamente a esa proteína en particular. Este proceso se puede utilizar para aislar y concentrar una proteína particular de una muestra que contiene muchos miles de proteínas diferentes. La inmunoprecipitación requiere que el anticuerpo se acople a un sustrato sólido en algún momento del procedimiento.
Implica el uso de un anticuerpo que es específico para una proteína conocida para aislar esa proteína en particular de una solución que contiene muchas proteínas diferentes. Estas soluciones estarán a menudo en forma de lisado crudo de un tejido vegetal o animal. Otros tipos de muestras pueden ser fluidos corporales u otras muestras de origen biológico.
La inmunoprecipitación de complejos proteicos intactos (es decir, el antígeno junto con cualquier proteína o ligando que esté unido a él) se conoce como co-inmunoprecipitación (Co-IP). Co-IP funciona seleccionando un anticuerpo que se dirige a una proteína conocida que se cree que es miembro de un complejo más grande de proteínas. Al apuntar a este miembro conocido con un anticuerpo, puede ser posible sacar todo el complejo proteico de la solución y así identificar miembros desconocidos del complejo.
Esto funciona cuando las proteínas involucradas en el complejo se unen entre sí estrechamente, lo que hace posible sacar varios miembros del complejo de la solución al adherirse a un miembro con un anticuerpo. Este concepto de extraer complejos de proteínas de la solución a veces se denomina "extracción". Co-IP es una técnica poderosa que los biólogos moleculares utilizan regularmente para analizar las interacciones proteína-proteína .
La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es un método que se utiliza para determinar la ubicación de los sitios de unión del ADN en el genoma para una proteína de interés particular . Esta técnica da una imagen de las interacciones proteína-ADN que ocurren dentro del núcleo de células o tejidos vivos . La naturaleza in vivo de este método contrasta con otros enfoques empleados tradicionalmente para responder a las mismas preguntas.
El principio que sustenta este ensayo es que las proteínas de unión al ADN (incluidos los factores de transcripción y las histonas ) en las células vivas pueden reticularse con el ADN al que se unen. Mediante el uso de un anticuerpo que es específico para una supuesta proteína de unión al ADN, se puede inmunoprecipitar el complejo proteína-ADN a partir de los lisados celulares. La reticulación a menudo se logra aplicando formaldehído a las células (o tejido), aunque a veces es ventajoso utilizar un reticulante más definido y consistente, como peróxido de di- terc -butilo (DTBP). Después de la reticulación, las células se lisan.y el ADN se rompe en pedazos de 0,2 a 1,0 kb de longitud mediante sonicación . En este punto, se realiza la inmunoprecipitación que da como resultado la purificación de los complejos proteína-ADN. Los complejos purificados de proteína-ADN luego se calientan para revertir el entrecruzamiento de formaldehído de los complejos de proteína y ADN, lo que permite que el ADN se separe de las proteínas. La identidad y la cantidad de los fragmentos de ADN aislados se pueden determinar mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La limitación de realizar la PCR en los fragmentos aislados es que uno debe tener una idea de qué región genómica se está dirigiendo para generar los cebadores de PCR correctos. A veces, esta limitación se evita simplemente clonando el ADN genómico aislado en un vector plasmídico.y luego usando cebadores que son específicos de la región de clonación de ese vector. Alternativamente, cuando se quiere encontrar dónde se une la proteína en una escala de todo el genoma, se utiliza la secuenciación de ChIP y ha surgido recientemente como una tecnología estándar que puede localizar los sitios de unión a proteínas de una manera rentable y de alto rendimiento, permitiendo también para la caracterización del cistroma . Anteriormente, también se utilizaba el microarray de ADN ( ChIP-on-chip o ChIP-chip ).
