La criotomografía electrónica ( CryoET ) es una técnica de obtención de imágenes que se utiliza para producir vistas tridimensionales de alta resolución (~ 1–4 nm) de muestras, normalmente macromoléculas y células biológicas . [1] [2] CryoET es una aplicación especializada de criomicroscopía electrónica de transmisión (CryoTEM) en la que se obtienen imágenes de las muestras a medida que se inclinan, lo que da como resultado una serie de imágenes en 2D que se pueden combinar para producir una reconstrucción en 3D, similar a una tomografía computarizada. del cuerpo humano. A diferencia de otras técnicas de tomografía electrónica , las muestras se inmovilizan en hielo no cristalino ("vítreo") y se obtienen imágenes en condiciones criogénicascondiciones (<−150 ° C), lo que les permite obtener imágenes sin deshidratación o fijación química, que de otro modo podrían alterar o distorsionar las estructuras biológicas. [3] [4]
Descripción de la técnica
En microscopía electrónica (EM), las muestras se obtienen en un vacío ultra alto. Tal vacío es incompatible con muestras biológicas como células; el agua herviría y la diferencia de presión haría explotar la celda. En las técnicas de EM a temperatura ambiente, las muestras se preparan por tanto mediante fijación y deshidratación. Sin embargo, otro método para estabilizar muestras biológicas es congelarlas ( criomicroscopía electrónica ). Al igual que en otras técnicas de criomicroscopía electrónica, las muestras para CryoET (típicamente células pequeñas (por ejemplo , bacterias , arqueas o virus ) se preparan en un medio acuoso estándar y se aplican a una rejilla EM. Luego, la rejilla se sumerge en un criógeno (típicamente etano ) de manera tan eficiente que las moléculas de agua no tienen tiempo para reorganizarse en una red cristalina . [3] El estado de agua resultante se llama "hielo vítreo" y conserva las estructuras celulares nativas, como las membranas lipídicas , que normalmente se destruirían por congelación. Muestras congeladas por inmersión posteriormente se almacenan y se obtienen imágenes a temperaturas de nitrógeno líquido para que el agua nunca se caliente lo suficiente como para cristalizar.
Las muestras se obtienen en un microscopio electrónico de transmisión (TEM). Como en otras técnicas de tomografía electrónica , la muestra se inclina en diferentes ángulos con respecto al haz de electrones (típicamente cada 1 o 2 grados desde aproximadamente -60 ° a + 60 °), y se adquiere una imagen en cada ángulo. [5] Esta serie de imágenes inclinadas se puede reconstruir computacionalmente en una vista tridimensional del objeto de interés. [6] Esto se llama tomografía o reconstrucción tomográfica.
Aplicaciones
En la microscopía electrónica de transmisión (TEM), debido a que los electrones interactúan fuertemente con la materia, la resolución está limitada por el grosor de la muestra. Además, el grosor de la muestra aumenta a medida que se inclina, y las muestras más gruesas pueden bloquear completamente el haz de electrones, haciendo que la imagen sea oscura o completamente negra. Por lo tanto, para CryoET, las muestras deben tener un grosor inferior a ~ 500 nm para lograr una resolución "macromolecular" (~ 4 nm). Por esta razón, la mayoría de los estudios de TEC se han centrado en complejos macromoleculares purificados, virus o células pequeñas como las de muchas especies de bacterias y arqueas. [1]
Se pueden preparar células más grandes, e incluso tejidos, para CryoET mediante adelgazamiento, ya sea mediante crio-seccionamiento o mediante fresado con haz de iones enfocado (FIB). En el crio-seccionamiento, los bloques congelados de células o tejido se seccionan en muestras delgadas con un crio- microtomo . [7] En la molienda FIB, las muestras congeladas por inmersión se exponen a un haz de iones enfocado, típicamente galio, que corta con precisión el material de la parte superior e inferior de una muestra, dejando una laminilla delgada adecuada para la obtención de imágenes de ECT. [8]
La fuerte interacción de los electrones con la materia también da como resultado un efecto de resolución anisotrópica. A medida que la muestra se inclina durante la formación de imágenes, el haz de electrones interactúa con un área de sección transversal relativamente mayor en ángulos de inclinación más altos. En la práctica, los ángulos de inclinación superiores a aproximadamente 60–70 ° no proporcionan mucha información y, por lo tanto, no se utilizan. Esto da como resultado una "cuña faltante" de información en el tomograma final que disminuye la resolución paralela al haz de electrones. [6]
Para estructuras que están presentes en múltiples copias en uno o múltiples tomogramas, se puede obtener una resolución más alta (incluso ≤ 1 nm) mediante el promedio de subtomogramas. [9] [10] Similar al análisis de partículas individuales , el promedio de subtomogramas combina de forma computacional imágenes de objetos idénticos para aumentar la relación señal-ruido .
Un obstáculo importante en CryoET es la identificación de estructuras de interés dentro de entornos celulares complicados. Una solución es aplicar correlacionada crio microscopía de fluorescencia de luz , [11] e incluso super-resolución microscopía de luz (por ejemplo, Cryo-PALM [12] ), y CryoET. En estas técnicas, una muestra que contiene una proteína de interés marcada con fluorescencia se congela por inmersión y se obtiene una imagen en un microscopio óptico equipado con una platina especial para permitir que la muestra se mantenga a temperaturas de subcristalización (<-150 ° C). Se identifica la ubicación de la señal fluorescente y la muestra se transfiere al CryoTEM, donde CryoET obtiene imágenes de la misma ubicación en alta resolución.
Ver también
Referencias
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enlaces externos
- Introducción al curso cryo-EM (Caltech)