RMCE ( intercambio de casetes mediado por recombinasa ) es un procedimiento en genética inversa que permite la modificación sistemática y repetida de genomas eucariotas superiores mediante integración dirigida, basada en las características de los procesos de recombinación específicos del sitio (SSR). Para RMCE, esto se logra mediante el intercambio limpio de un casete de genes preexistente por un casete análogo que lleva el "gen de interés" (GOI).
La modificación genética de células de mamíferos es un procedimiento estándar para la producción de proteínas correctamente modificadas con relevancia farmacéutica. Para tener éxito, la transferencia y expresión del transgén debe ser altamente eficiente y debe tener un resultado en gran medida predecible. Los desarrollos actuales en el campo de la terapia génica se basan en los mismos principios. Los procedimientos tradicionales utilizados para la transferencia de GOI no son lo suficientemente confiables, principalmente porque las influencias epigenéticas relevantes no se han explorado lo suficiente: los transgenes se integran en cromosomas con baja eficiencia y en loci que proporcionan solo condiciones subóptimas para su expresión.. Como consecuencia, la información recién introducida puede no realizarse (expresarse), el gen o los genes pueden perderse y / o reinsertarse y pueden hacer que las células diana se vuelvan inestables. Es exactamente en este punto donde RMCE entra al campo. El procedimiento se introdujo en 1994 [1] y utiliza las herramientas que las levaduras y los bacteriófagos [2] han desarrollado para la replicación eficiente de información genética importante:
Principios generales
La mayoría de las cepas de levadura contienen ADN circulares similares a plásmidos llamados "círculos de dos micrones". La persistencia de estas entidades es otorgada por una recombinasa llamada "flippase" o "Flp" . Cuatro monómeros de esta enzima se asocian con dos sitios diana idénticos cortos (48 pb), llamados FRT ("dianas flip-recombinasa"), lo que resulta en su cruzamiento . El resultado de tal proceso depende de la orientación relativa de los FRT participantes que conducen a
- la inversión de una secuencia que está flanqueada por dos sitios FRT idénticos pero orientados inversamente
- la eliminación / resolución de una secuencia que está flanqueada por dos orientados igualmente idénticos FRT s
- la reversión ineficiente del proceso de letras, comúnmente llamado integración o "adición" de una pieza adicional de ADN que lleva un único sitio FRT idéntico al sitio objetivo
Este espectro de opciones podría extenderse significativamente mediante la generación de mutantes espaciadores para sitios FRT extendidos de 48 pb ( semiflechas entrecruzadas en la Figura 1). Cada Fn mutante se recombina con un Fn mutante idéntico con una eficacia igual a los sitios de tipo salvaje (F x F). Una interacción cruzada (F x Fn) se evita estrictamente mediante el diseño particular de estos componentes. Esto prepara el escenario para la situación que se muestra en la Figura 1A:
- un casete objetivo (aquí un marcador de selección +/- compuesto) está flanqueado por un sitio F- y un sitio Fn. Después de su introducción en el genoma de una célula huésped, se caracterizan las propiedades de muchos sitios de integración ("direcciones" genómicas) y se aíslan los clones apropiados.
- el GOI (gen de interés) es parte de un "plásmido de intercambio" circular y está flanqueado por un conjunto de sitios coincidentes. Este plásmido de intercambio se puede introducir en la célula en un gran exceso molecular y, por lo tanto, se someterá a la reacción de intercambio representada (RMCE-) con la dirección genómica preseleccionada (es decir, la diana F <+/-> Fn).
- este principio de RMCE es un proceso que puede repetirse con el mismo plásmido de intercambio o con uno diferente ("RMCE en serie"). Tenga en cuenta que RMCE introduce solo una copia del GOI en el locus predeterminado y que no introduce conjuntamente secuencias de vectores procarióticos (líneas de puntos) que de otro modo desencadenarían mecanismos de defensa inmunológicos o epigenéticos.
Aplicado por primera vez para la Tyr-recombinasa Flp, este nuevo procedimiento no solo es relevante para la construcción racional de líneas celulares biotecnológicamente significativas, sino que también encuentra un uso cada vez mayor para la generación sistemática de células madre . Las células madre se pueden utilizar para reemplazar tejido dañado o para generar animales transgénicos con propiedades en gran parte predeterminadas.
RMCE doble
Se ha establecido previamente que la coexpresión de recombinasas Cre y Flp cataliza el intercambio de secuencias flanqueadas por sitios loxP y FRT únicos integrados en el genoma en una ubicación aleatoria. Sin embargo, estos estudios no exploraron si tal enfoque podría usarse para modificar alelos condicionales de ratón que llevan sitios loxP y FRT únicos o múltiples. El RMCE dual (dRMCE; Osterwalder et al., 2010) se desarrolló recientemente como una herramienta de reingeniería aplicable a la gran cantidad de alelos condicionales de ratón que albergan sitios loxP y FRT de tipo salvaje y, por lo tanto, no son compatibles con RMCE convencional. La estrategia general de dRMCE aprovecha el hecho de que la mayoría de los alelos condicionales codifican un casete de selección flanqueado por sitios FRT, además de sitios loxP que flanquean exones funcionalmente relevantes (exones "floxados"). El casete de selección flanqueado por FRT se coloca en general fuera de la región flanqueada por loxP, lo que hace que estos alelos sean directamente compatibles con dRMCE. La expresión simultánea de las recombinasas Cre y Flp induce la recombinación cis y la formación del alelo delecionado, que luego sirve como un "sitio de acoplamiento" en el que insertar el vector de sustitución mediante recombinación trans. El locus reemplazado correctamente codificaría la modificación personalizada y un casete de selección de fármaco diferente flanqueado por sitios loxP y FRT únicos. Por lo tanto, dRMCE aparece como una herramienta muy eficiente para la reingeniería dirigida de miles de alelos de ratón producidos por el consorcio IKMC.
RMCE de multiplexación
Las configuraciones de multiplexación se basan en el hecho de que cada par F-Fn (que consta de un sitio FRT de tipo salvaje y un mutante llamado "n") o cada par Fn-Fm (que consta de dos mutantes, "m" y "n") constituye un único "dirección" en el genoma. Un requisito previo son las diferencias en cuatro de las ocho posiciones del espaciador (consulte la Figura 1B). Si la diferencia está por debajo de este umbral, puede ocurrir alguna interacción cruzada entre los mutantes que conduzca a una deleción defectuosa de la secuencia entre los sitios heteroespecíficos (Fm / Fn o F / Fn).
Mientras tanto, se encuentran disponibles 13 mutantes FRT [3] [4] , que permiten el establecimiento de varias direcciones genómicas únicas una al lado de la otra (por ejemplo, F-Fn y Fm-Fo). Estas direcciones serán reconocidas por plásmidos donantes que han sido diseñados de acuerdo con los mismos principios, permitiendo modificaciones sucesivas (pero también sincrónicas) en los loci predeterminados . Estas modificaciones se pueden llevar a cabo en caso de que el plásmido o los plásmidos donantes compatibles se proporcionen en exceso (principios de acción en masa). La Figura 2 ilustra un uso del principio de multiplexación: la extensión escalonada de una región de codificación en la que se proporciona una unidad de expresión básica con aislantes genómicos , potenciadores u otros elementos que actúan en cis .
Una variación reciente del concepto general se basa en PhiC31 (una integrasa de la clase Ser) , que permite la introducción de otro objetivo RMCE en un sitio secundario después de que se haya producido la primera modificación basada en RMCE. Esto se debe al hecho de que cada intercambio catalizado por phiC31 destruye los sitios attP y attB que ha abordado [2] convirtiéndolos en sitios de producto att R y att L , respectivamente. Si bien estos cambios permiten el montaje posterior de objetivos nuevos (y muy probablemente remotos), no permiten abordar varios objetivos de RMCE en paralelo , ni permiten "RMCE en serie", es decir, modificaciones sucesivas y escalonadas en un locus genómico dado.
Esto es diferente para Flp-RMCE, para el cual el estado posterior a RMCE de los FRT corresponde a su estado inicial. Esta propiedad permite la movilización intencionada y repetida de un casete diana mediante la adición de un nuevo plásmido donante con arquitectura compatible. Estas opciones de "RMCE multiplexado" abren posibilidades ilimitadas para modificaciones específicas en serie y en paralelo de objetivos RMCE predeterminados [5]
Aplicaciones
Generación de animales transgénicos
Generación de transgénicos knock-out / -in ratones y su modificación genética por RMCE. [6] [7]
Marcado e intercambio de casetes en células DG44 en cultivo en suspensión
Inserción de un casete diana en una línea de células hospedadoras de mamífero (CHO DG44 en cultivo en suspensión) e intercambio con una construcción de indicador de estrés ER mediante integración dirigida (RMCE). [8]
Ver también
Referencias
- ^ Schlake, T., Bode, J. (1994). "Uso de sitios de diana de reconocimiento de Flp mutados ( FRT -) para el intercambio de casetes de expresión en loci cromosómicos definidos ". Bioquímica . 33 (43): 12746-12751. doi : 10.1021 / bi00209a003 . PMID 7947678 .
- ^ a b Bateman, Jack R; Anne M. Lee; C.-ting Wu (junio de 2006). "Transformación de sitio específico de Drosophila a través de intercambio de casete mediada por phiC31-Integrasa" . Genética . 173 (2): 769–777. doi : 10.1534 / genetics.106.056945 . PMC 1526508 . PMID 16547094 .
- ^ Bode, J; T. Schlake; M. Iber; D. Schübeler; J. Seibler; E. Snezhkov; L. Nikolaev (2000). "Caja de herramientas del transgenetista - Nuevos métodos para la modificación dirigida de genomas eucariotas". Biol. Chem . 381 (9–10): 801–813. doi : 10.1515 / BC.2000.103 . PMID 11076013 .
- ^ Turan, S .; Kuehle, J .; Schambach, A .; Baum, C .; Bode, J. (2010). "RMCE de multiplexación: Extensiones versátiles de la tecnología de intercambio de cassette mediada por Flp-Recombinase". J. Mol. Biol . 402 (1): 52–69. doi : 10.1016 / j.jmb.2010.07.015 . PMID 20650281 .
- ^ Turan, S; J. Bode (2011). "Recombinasas específicas del sitio: desde la etiqueta y la diana hasta la etiqueta y las modificaciones genómicas basadas en el intercambio". FASEB J . 25 (12): 4088–4107. doi : 10.1096 / fj.11-186940 . PMID 21891781 .
- ^ Cesari F, Rennekampff V, Vintersten K, Vuong LG, Seibler J, Bode J, Wiebel FF, Nordheim A (febrero de 2004). "Ratones knock-out Elk-1 diseñados por intercambio de cassette mediado por recombinasa Flp". Génesis . 38 (2): 87–92. doi : 10.1002 / gene.20003 . PMID 14994271 .
- ^ Roebroek AJ, Reekmans S, Lauwers A, Feyaerts N, Smeijers L, Hartmann D (enero de 2006). "Los ratones knock-in de Lrp1 mutantes generados por el intercambio de casetes mediado por recombinasa revelan la importancia diferencial de los motivos NPXY en el dominio intracelular de LRP1 para el desarrollo fetal normal" . Mol Cell Biol . 26 (2): 605–16. doi : 10.1128 / MCB.26.2.605-616.2006 . PMC 1346909 . PMID 16382151 .
- ^ Kober L, Zehe C, Bode J (octubre de 2012). "Desarrollo de un nuevo sistema de selección basado en estrés ER para el aislamiento de clones altamente productivos". Biotechnol. Bioeng . 109 (10): 2599–611. doi : 10.1002 / bit.24527 . PMID 22510960 .
- J. Bode, S. Götze, M. Klar, K. Maaß, K. Nehlsen, A. Oumard y S. Winkelmann (2004) BIOForum 34-36 Den Viren nachempfunden: Effiziente Modifikation von Säugerzellen.
- Cesari F, Rennekampff V, Vintersten K, Vuong LG, Seibler J, Bode J, Wiebel FF, Nordheim A (2004). "Ratones knock-out Elk-1 diseñados por intercambio de cassette mediado por recombinasa Flp". Génesis . 38 (2): 87–92. doi : 10.1002 / gene.20003 . PMID 14994271 .
- Roebroek, AJM; Reekmans, S .; Lauwers, A .; Feyaerts, N .; Smeijers, L .; Hartmann, D. (2006). "Los ratones knock-in de Lrp1 mutantes generados por RMCE revelan la importancia diferencial de los motivos NPXY en el dominio intracelular de LRP1 para el desarrollo fetal normal" . Mol. Célula. Biol . 26 (2): 605–616. doi : 10.1128 / MCB.26.2.605-616.2006 . PMC 1346909 . PMID 16382151 .
- Branda, CS; Dymecki, SM (2004). "Hablando de una revolución: el impacto de las recombinasas específicas del sitio en los análisis genéticos en ratones. Desarrollar". Célula de desarrollo . 6 (1): 7-28. doi : 10.1016 / S1534-5807 (03) 00399-X . PMID 14723844 .
- Oumard, A .; Qiao, J .; Jostock, T .; Li, J .; Bode, J. (2006). "Método recomendado para la explotación de cromosomas: sistemas de intercambio de casetes basados en RMCE en biotecnología de células animales" . Citotecnología . 50 (1-3): 93-108. doi : 10.1007 / s10616-006-6550-0 . PMC 3476001 . PMID 19003073 .
- Qiao, J .; Oumard, A .; Wegloehner, W .; Bode, J. (2009). "Nuevas estrategias de etiquetado e intercambio (RMCE) generan clones de células maestras con propiedades de expresión transgénica predecibles y estables". J. Mol. Biol . 390 (4): 579–594. doi : 10.1016 / j.jmb.2009.05.012 . hdl : 10033/76653 . PMID 19447116 .
- Turan, Soeren; Galla, Melanie; Ernst, Ellen; Qiao, Junhua; Voelkel, Christine; Schiedlmeier, Bernhard; Zehe, Christoph; Bode, Juergen (2011). "Intercambio de casetes mediado por recombinasa (RMCE): conceptos tradicionales y desafíos actuales". Revista de Biología Molecular . 407 (2): 193–221. doi : 10.1016 / j.jmb.2011.01.004 . PMID 21241707 .
- Turan, S; Zehe, C; Kuehle, J; Qiao, J; Bode, J (2013). "Intercambio de casetes mediado por recombinasa (RMCE) - una caja de herramientas de rápida expansión para modificaciones genómicas específicas". Gene . 515 (1): 1–27. doi : 10.1016 / j.gene.2012.11.016 . PMID 23201421 .
- Lauth, M .; Spreafico, F .; Dethleffsen, K .; Meyer, M (2002). "Intercambio de casete estable y eficiente en condiciones no seleccionables mediante el uso combinado de dos recombinasas específicas del sitio" . Ácidos nucleicos Res . 30 (21): e115. doi : 10.1093 / nar / gnf114 . PMC 135837 . PMID 12409474 .
- Osterwalder, Marco; Galli, Antonella; Rosen, Barry; Skarnes, William C; Zeller, Rolf; López-Ríos, Javier (2010). "Dual RMCE para la reingeniería eficiente de alelos mutantes de ratón" . Métodos de la naturaleza . 7 (11): 893–895. doi : 10.1038 / nmeth.1521 . PMC 3576631 . PMID 20953177 .
enlaces externos
- https://www.sciencedaily.com/releases/2011/11/111130115822.htm