El sistema GAL4-UAS es un método bioquímico utilizado para estudiar la expresión y función de genes en organismos como la mosca de la fruta . También se ha adaptado para estudiar las funciones de unión química del receptor in vitro en cultivo celular . Fue desarrollado por Hitoshi Kakidani y Mark Ptashne, [1] y Nicholas Webster y Pierre Chambon [2] en 1988, luego adaptado por Andrea Brand y Norbert Perrimon en 1993 [3] y se considera una técnica poderosa para estudiar la expresión de genes . [4]El sistema tiene dos partes: el gen Gal4 , que codifica la proteína activadora de la transcripción de levadura Gal4 , y el UAS ( secuencia de activación ascendente ), un potenciador al que GAL4 se une específicamente para activar la transcripción génica .
Descripción general
El sistema Gal4 permite separar los problemas de definir qué células expresan un gen o proteína y qué quiere hacer el experimentador con este conocimiento. Los genetistas han creado variantes genéticas de organismos modelo (típicamente moscas de la fruta), llamadas líneas GAL4 , cada una de las cuales expresa GAL4 en algún subconjunto de los tejidos del animal. Por ejemplo, algunas líneas pueden expresar GAL4 solo en células musculares, o solo en nervios, o solo en las antenas, etc. En el caso de las moscas de la fruta en particular, existen decenas de miles de estas líneas, y las más útiles expresan GAL4 solo en un subconjunto muy específico del animal; tal vez, por ejemplo, solo en aquellas neuronas que conectan dos compartimentos específicos del cerebro de la mosca. La presencia de GAL4, por sí sola, en estas células tiene poco o ningún efecto, ya que el efecto principal de GAL4 es unirse a una región UAS y la mayoría de las células no tienen regiones UAS (o son inocuas).
Dado que Gal4 por sí solo no es visible y tiene poco efecto en las células, la otra parte necesaria de este sistema son las "líneas informadoras". Estas son cepas de moscas con la región UAS especial junto a un gen deseado. Estas instrucciones genéticas ocurren en cada célula del animal, pero en la mayoría de las células no sucede nada, ya que esa célula no produce GAL4. En las células que están produciendo GAL4, sin embargo, la UAS se activa, el gen junto a él está activada, y se inicia la producción de su proteína resultante. Esto puede informar al investigador qué células expresan GAL4, de ahí el término "línea informadora", pero también se utilizan a menudo genes destinados a manipular el comportamiento celular.
Los genes reporteros típicos incluyen:
- Proteínas fluorescentes como proteínas verdes (GFP) o rojas fluorescentes (RFP), que permiten a los científicos ver qué células expresan Gal4
- Canalrodopsina , que permite la activación de células nerviosas por sensibilidad a la luz.
- Halorhodopsin , que a la inversa permite que la luz suprima el disparo de neuronas
- Shibire, que apaga las neuronas, pero solo a temperaturas más altas (30 ° C y más). Las moscas con este gen se pueden criar y probar a temperaturas más bajas donde sus neuronas se comportarán normalmente. Entonces se puede elevar la temperatura corporal de las moscas (ya que son de sangre fría ) y estas neuronas se apagan. [5] Si el comportamiento de la mosca cambia, esto da una pista clara de lo que hacen esas neuronas.
- GECI ( G enetically E ncoded C alcium I ndicator), a menudo un miembro de la GCaMP familia de proteínas. Estas proteínas emiten fluorescencia cuando se exponen al calcio , lo que, en la mayoría de las células, ocurre cuando se activa la neurona. Esto permite a los científicos tomar fotografías o películas que muestren el funcionamiento del sistema nervioso.
Por ejemplo, los científicos pueden visualizar primero una clase de neuronas eligiendo una mosca de una línea GAL4 que exprese GAL4 en el conjunto deseado de neuronas y cruzándola con una línea indicadora que exprese GFP. En la descendencia, el subconjunto deseado de células producirá GAL4, y en estas células, el GAL4 se unirá al UAS y permitirá la producción de GFP. Entonces, el subconjunto deseado de células ahora tendrá una fluorescencia verde y se puede seguir con un microscopio de fluorescencia . A continuación, para averiguar qué podrían hacer estas células, el experimentador podría expresar canalrodopsina en cada una de estas células, cruzando la misma línea GAL4 con una línea indicadora de canalrodopsina. En la descendencia, las células seleccionadas, y solo esas células, contendrán canalrodopsina y pueden activarse con una luz brillante. Ahora el científico puede activar estas células en particular a voluntad y examinar el comportamiento resultante para ver qué podrían hacer estas células.
Operación
Gal4 es una proteína modular que consta en general de un dominio de unión al ADN y un dominio de activación. El UAS al que se une GAL4 es CGG-N 11 -CCG, donde N puede ser cualquier base . [6] Aunque GAL4 es una proteína de levadura que normalmente no está presente en otros organismos, se ha demostrado que funciona como activador de la transcripción en una variedad de organismos como Drosophila , [7] y células humanas, destacando que los mismos mecanismos de expresión génica han conservado a lo largo de la evolución. [2]
Para el estudio en Drosophila , el gen GAL4 se coloca bajo el control de un promotor genético nativo , o gen conductor, mientras que el UAS controla la expresión de un gen diana. Entonces, GAL4 solo se expresa en células donde el gen conductor suele estar activo. A su vez, GAL4 solo debería activar la transcripción de genes donde se ha introducido un UAS. Por ejemplo, fusionando un gen que codifica un marcador visible como GFP (proteína verde fluorescente ), se puede determinar el patrón de expresión de los genes impulsores. GAL4 y UAS son muy útiles para estudiar la expresión génica en Drosophila ya que normalmente no están presentes y su expresión no interfiere con otros procesos en la célula. Por ejemplo, los transgenes regulados por GAL4 / UAS en Drosophila se han utilizado para alterar la expresión glial para producir un comportamiento arrítmico en una salida circadiana rítmica conocida llamada factor de dispersión de pigmentos (PDF). [8] Sin embargo, algunas investigaciones han indicado que la sobreexpresión de GAL4 en Drosophila puede tener efectos secundarios, probablemente relacionados con las respuestas inmunitarias y de estrés a lo que es esencialmente una proteína extraña. [9]
El sistema GAL4-UAS también se ha empleado para estudiar la expresión génica en organismos además de Drosophila , como la rana de garras africana Xenopus [10] y el pez cebra . [11]
El sistema GAL4 / UAS también se utiliza en el cribado de dos híbridos , un método para identificar interacciones entre dos proteínas o una proteína con el ADN.
Extensiones
La expresión de Gal4 puede hacerse aún más específica mediante "estrategias interseccionales". Estos pueden combinar dos líneas GAL4 diferentes, digamos, A y B, de manera que GAL4 solo se exprese en las celdas que están en la línea A pero no en la línea B, o en las que están en las líneas A y B. Cuando se combinan con intrínsecamente líneas GAL4 dispersas, esto ofrece una selección muy específica, a menudo limitada a un solo tipo de célula. La desventaja es que se requieren al menos tres sitios de inserción independientes, por lo que las líneas deben usar sitios de inserción diferentes e independientes, y la creación de los organismos finales deseados requiere más de un solo cruce. Este es un campo de investigación muy activo, y existen muchas de estas estrategias interseccionales, de las cuales dos se analizan a continuación.
Una forma de crear la expresión de GAL4 en las células que están en la línea A pero no en la línea B, requiere que la línea A exprese GAL4 y la línea B exprese Gal80 , que es un inhibidor de GAL4. Por lo tanto, solo las células que están en A pero no en B tendrán GAL4 activo, que luego puede impulsar el gen indicador . [12] [13]
Para expresar GAL4 sólo en las células contenidas tanto en A como en B, se puede utilizar una técnica llamada "split-GAL4". La línea A está hecha para expresar la mitad de la proteína GAL4, que es inactiva por sí misma. De manera similar, la línea B está hecha para expresar la otra mitad de GAL4, también inactiva por sí misma. Solo las células que están en ambas líneas forman ambas mitades, que se autoensamblan mediante una cremallera de leucina en GAL4 y activan el gen indicador. [14]
Referencias
- ^ Kakidani, Hitoshi; Ptashne, Mark (1988). "GAL4 activa la expresión génica en células de mamíferos". Celular . 52 (2): 161-167. doi : 10.1016 / 0092-8674 (88) 90504-1 . PMID 2830021 .
- ^ a b Webster, N .; Jin, JR; Green, S .; Hollis, M .; Chambon, P. (1988). "La levadura UASG es un potenciador de la transcripción en células HeLa humanas en presencia del trans-activador GAL4". Celular . 52 (2): 169–78. doi : 10.1016 / 0092-8674 (88) 90505-3 . PMID 2830022 .
- ^ Brand, AH ; Perrimon, N. (1993). "La expresión génica dirigida como medio para alterar el destino celular y generar fenotipos dominantes" . Desarrollo . 118 (2): 401–415. PMID 8223268 .
- ^ Duffy, JB (2002). "Sistema GAL4 en Drosophila: navaja suiza de un genetista de moscas". Génesis . 34 (1–2): 1–15. doi : 10.1002 / gene.10150 . PMID 12324939 . S2CID 5073328 .
- ^ Kitamoto, Toshihiro (2001). "Modificación condicional del comportamiento en Drosophila por expresión dirigida de un alelo shibire sensible a la temperatura en neuronas definidas". Revista de neurobiología . 47 (2): 81–92. doi : 10.1002 / neu.1018 . PMID 11291099 .
- ^ Campbell, RN; Leverentz, MK; Ryan, LA; Reece, RJ (2008). "Control metabólico de la transcripción: paradigmas y lecciones de Saccharomyces cerevsiae ". Revista bioquímica . 414 (2): 177–87. doi : 10.1042 / BJ20080923 . PMID 18687061 . S2CID 19379977 .
- ^ Janice A. Fischer; Edward Giniger; Tom Maniatis; Mark Ptashne (1988). "GAL4 activa la transcripción en Drosophila ". Naturaleza . 332 (6167): 853–6. doi : 10.1038 / 332853a0 . PMID 3128741 .
- ^ Ng, FS; Tangredi, MM; Jackson, FR (abril de 2011). "Las células gliales modulan fisiológicamente las neuronas del reloj y el comportamiento circadiano de una manera dependiente del calcio" . Biología actual . 21 (8): 625–34. doi : 10.1016 / j.cub.2011.03.027 . PMC 3081987 . PMID 21497088 .
- ^ Liu Y, Lehman M (2008). "Una respuesta genómica al factor de transcripción de levadura GAL4 en Drosophila " . Vuela (Austin) . 2 (2): 92–8. doi : 10.4161 / fly.6311 . PMC 2803330 . PMID 18820459 .
- ^ Katharine O. Hartley; Stephen L. Nutt; Enrique Amaya (2002). "Expresión génica dirigida en Xenopus transgénico utilizando el sistema binario Gal4-UAS" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 99 (3): 1377–82. doi : 10.1073 / pnas.022646899 . PMC 122198 . PMID 11818539 .
- ^ Davison, JM; Akitake CM; Goll MG; Rhee, JM; Gosse, N .; Baier, H .; Halpern, ME; Leach, SD; Parsons, MJ (2007). "Transactivación de inserciones transgénicas Gal4-VP16 para el etiquetado de células específicas de tejido y ablación en pez cebra" . Biología del desarrollo . 304 (2): 811–24. doi : 10.1016 / j.ydbio.2007.01.033 . PMC 3470427 . PMID 17335798 .
- ^ Suster, Maximiliano, L., Seugnet, Laurent, Bate, Michael y Sokolowski, Marla B. (2004). "Refinando la expresión del transgén dirigida por GAL4 en Drosophila con una trampa potenciadora de GAL80" (PDF) . Génesis . 39 (4): 240–245. doi : 10.1002 / gene.20051 . PMID 15286996 .Mantenimiento de CS1: utiliza el parámetro de autores ( enlace )[ enlace muerto permanente ]
- ^ Fujimoto, Esther; Gaynes, Brooke; Brimley, Cameron; J. Chien, Chi-Bin y Bonkowsky, Joshua L. (2011). "Regulación interseccional Gal80 de expresión específica de tipo celular en vertebrados" . Dinámica del desarrollo . 240 (10): 2324–2334. doi : 10.1002 / dvdy.22734 . PMC 3178006 . PMID 21905164 .
- ^ Luan, Haojiang; Peabody, Nathan C .; Vinson, Charles R. y White, Benjamin H. (2006). "Manipulación espacial refinada de la función neuronal por restricción combinatoria de la expresión transgénica" . Neurona . 52 (3): 425–436. doi : 10.1016 / j.neuron.2006.08.028 . PMC 1713190 . PMID 17088209 .