GCaMP es un indicador de calcio codificado genéticamente (GECI) desarrollado inicialmente en 2001 por Junichi Nakai. [1] Es una fusión sintética de proteína verde fluorescente (GFP), calmodulina (CaM) y M13, una secuencia peptídica de la quinasa de cadena ligera de miosina . [2] Cuando se une a Ca 2+ , GCaMP presenta una fluorescencia verde con una longitud de onda de excitación máxima de 480 nm y una longitud de onda de emisión máxima de 510 nm. [3] Se utiliza en la investigación biológica para medir los niveles de Ca 2+ intracelular tanto in vitro como in vivo utilizando virus líneas celulares y animales transfectadas o transgénicas . [2] [4] La secuencia genética que codifica GCaMP puede insertarse bajo el control de promotores exclusivos de ciertos tipos de células, lo que permite la expresión específica de GCaMP del tipo celular. [5] Dado que el Ca 2+ es un segundo mensajero que contribuye a muchos mecanismos celulares y vías de señalización , GCaMP permite a los investigadores cuantificar la actividad de los mecanismos basados en Ca 2+ y estudiar el papel de los iones Ca 2+ en los procesos biológicos de interés.
Estructura
GCaMP consta de tres dominios clave: un dominio M13 en el N-terminal , un dominio de calmodulina (CaM) en el C-terminal y un dominio GFP en el centro. El dominio GFP se permuta circularmente de modo que los extremos N y C nativos se fusionan mediante una secuencia de enlace de seis aminoácidos , y la secuencia GFP se divide en el medio, creando nuevos extremos N y C que se conectan a los dominios M13 y CaM. [6]
En ausencia de Ca 2+ , el cromóforo de GFP se expone al agua y existe en un estado protonado con mínima intensidad de fluorescencia. Tras la unión de Ca 2+ , el dominio CaM sufre un cambio conformacional y se une fuertemente a la hélice alfa del dominio M13 , evitando que las moléculas de agua accedan al cromóforo. Como resultado, el cromóforo se desprotona rápidamente y se convierte en una forma aniónica que presenta una fluorescencia brillante, similar a la GFP nativa. [7]
Historia y desarrollo
En 2001, Nakai et al. informaron del desarrollo de GCaMP1 como una sonda de Ca 2+ con una relación señal-ruido mejorada en comparación con las sondas fluorescentes de Ca 2+ desarrolladas previamente . [1] El primer ratón transgénico que expresaba GCaMP1 se informó en 2004. [5] Sin embargo, a 37 ˚C (temperatura fisiológica en mamíferos), GCaMP1 no se dobló de manera estable ni emitió fluorescencia, lo que limita su uso potencial como indicador de calcio in vivo. [1] [8]
En 2006, Tallini et al. posteriormente informó la mejora de GCaMP1 a GCaMP2, que exhibió una fluorescencia más brillante que GCaMP1 y una mayor estabilidad a la temperatura corporal de los mamíferos . Tallini y col. expresó GCaMP2 en cardiomiocitos en embriones de ratón para realizar la primera imagen de GCaMP in vivo de Ca 2+ en mamíferos. [8]
Se han desarrollado más modificaciones de GCaMP, incluidas GCaMP3, GCaMP5, GCaMP6 y jGCaMP7, para mejorar progresivamente la señal, la sensibilidad y el rango dinámico de detección de Ca 2+ , [2] [9] [10] [11] con versiones recientes exhibiendo fluorescencia similar a la GFP nativa. [11]
Variantes en uso
Tanto las variantes lentas (GCaMP6s, jGCaMP7s) como las variantes rápidas (GCaMP6f, jGCaMP7f) se utilizan en la investigación biológica y neurocientífica . Las variantes lentas son más brillantes y más sensibles a pequeños cambios en los niveles de Ca 2+ , como los potenciales de acción únicos ; por otro lado, las variantes rápidas son menos sensibles pero responden más rápidamente, lo que las hace útiles para rastrear cambios en los niveles de Ca 2+ en escalas de tiempo precisas. [12] [13] GCaMP6 también tiene una variante media, GCaMP6m, cuya cinética es intermedia entre GCaMP6s y GCaMP6f. [12] También se emplean otras variantes de jGCaMP7: jGCaMP7b exhibe fluorescencia de línea de base brillante y se usa para obtener imágenes de dendritas y axones , mientras que jGCaMP7c exhibe un mayor contraste entre la fluorescencia máxima y de línea de base y es ventajoso para obtener imágenes de grandes poblaciones de neuronas. [12]
En 2018, Yang et al. informaron del desarrollo de GCaMP-X, generado por la adición de un motivo de unión a calmodulina. Dado que el dominio de calmodulina de GCaMP, cuando no se une, interrumpe la compuerta del canal de calcio de tipo L , el motivo de unión de calmodulina añadido evita que GCaMP-X interfiera con los mecanismos de señalización dependientes del calcio. [14]
En 2020, Zhang et al. informaron del desarrollo de jGCaMP8, incluidas las variantes sensibles, medias y rápidas, que exhiben una cinética más rápida y una mayor sensibilidad que las variantes de jGCaMP7 correspondientes. [15]
También se han desarrollado indicadores fluorescentes rojos: jRCaMP1a y jRCaMP1b utilizan una permutación circular de la proteína roja fluorescente mRuby en lugar de GFP, mientras que jRGECO1a se basa en la proteína roja fluorescente mApple. [12] [16] Dado que la luz azul utilizada para excitar GCaMP es dispersada por el tejido y la luz verde emitida es absorbida por la sangre, los indicadores fluorescentes rojos proporcionan más penetración y profundidad de imagen in vivo que GCaMP. El uso de indicadores fluorescentes rojos también evita el fotodaño causado por la luz de excitación azul. [16] Además, los indicadores fluorescentes rojos permiten el uso simultáneo de optogenética , lo que es difícil con GCaMP porque las longitudes de onda de excitación de GCaMP se superponen con las de la canalrodopsina-2 (ChR2). [16] [17] El uso simultáneo de GECI rojos y verdes puede proporcionar una visualización en dos colores de diferentes regiones subcelulares o poblaciones de células. [16] [17] [18]
Aplicaciones en investigación
Actividad neuronal
En las neuronas, los potenciales de acción inducen la liberación de neurotransmisores en los terminales de los axones al abrir canales de Ca 2+ dependientes de voltaje , lo que permite la entrada de Ca 2+ . Como resultado, GCaMP se usa comúnmente para medir los aumentos en el Ca 2+ intracelular en las neuronas como un proxy de la actividad neuronal en múltiples modelos animales, incluidos Caenorhabditis elegans , pez cebra , Drosophila y ratones . [19]
GCaMP ha jugado un papel vital en el establecimiento de grabaciones neuronales a gran escala en animales para investigar cómo los patrones de actividad en las redes neuronales influyen en el comportamiento. Por ejemplo, Nguyen et al. (2016) utilizaron GCaMP en imágenes de todo el cerebro durante el movimiento libre de C. elegans para identificar neuronas y grupos de neuronas cuya actividad se correlacionaba con conductas locomotoras específicas. [20]
Muto y col. (2003) expresaron GCaMP en embriones de pez cebra para medir y mapear la actividad coordinada de las neuronas motoras espinales en diferentes partes del cerebro durante el inicio, propagación y recuperación de las convulsiones inducidas por pentilenetetrazol . [21] La expresión de GCaMP en cerebros de pez cebra también se ha utilizado para estudiar la activación de circuitos neuronales en procesos cognitivos como la captura de presas, el control de impulsos y la atención. [22] [23]
Además, los investigadores han utilizado GCaMP para observar la actividad neuronal en ratones expresándola bajo el control del promotor Thy1 , que se encuentra en las neuronas piramidales excitadoras . [24] Por ejemplo, la integración de neuronas en circuitos durante el aprendizaje motor se ha seguido utilizando GCaMP para observar patrones de fluctuación sincronizados en los niveles de Ca 2+ . [25] [26] [27] GCaMP también se ha utilizado para observar la dinámica de Ca 2+ en los compartimentos subcelulares de las neuronas de ratón: Cichon y Gan (2015) utilizaron GCaMP para mostrar que las neuronas en la corteza motora del ratón exhiben aumentos de NMDA en Ca 2+ que son independientes para cada espina dendrítica , lo que muestra que las espinas dendríticas individuales regulan la plasticidad sináptica . [28] Finalmente, GCaMP se ha utilizado para identificar patrones de actividad en regiones específicas del cerebro del ratón. Por ejemplo, Jones et al. (2018) utilizaron GCaMP6 en ratones para medir la actividad neuronal en el núcleo supraquiasmático (SCN), el marcapasos circadiano de los mamíferos , y mostraron que las neuronas SCN que producían péptido intestinal vasoactivo (VIP) exhibían ritmos de actividad diaria in vivo que se correlacionaban con la liberación de VIP. [29]
GCaMP también se ha combinado con fotometría de fibra para medir los cambios de Ca 2+ a nivel de población dentro de subpoblaciones de neuronas en animales que se mueven libremente. [30] Por ejemplo, Clarkson et al. (2017) utilizaron este método para demostrar que las neuronas del núcleo arqueado del hipotálamo se sincronizan con los aumentos de Ca 2+ inmediatamente antes de los pulsos de la hormona luteinizante (LH). [31] Si bien las imágenes GCaMP con fotometría de fibra no pueden rastrear los cambios en los niveles de Ca 2+ dentro de las neuronas individuales, proporciona una mayor resolución temporal para cambios a gran escala. [32]
Conducción cardiaca
Las corrientes de Ca 2+ a través de las uniones gap de los cardiomiocitos median la contracción sincronizada del tejido cardíaco. Como resultado, la expresión de GCaMP en cardiomiocitos, tanto in vitro como in vivo , se ha utilizado para estudiar la excitación y contracción dependientes del flujo de Ca 2+ en peces cebra y ratones. [33] Por ejemplo, Tallini et al. (2006) expresaron GCaMP2 en embriones de ratón para demostrar que, en el día embrionario 10,5, la conducción eléctrica era rápida en las aurículas y los ventrículos, pero lenta en el canal auriculoventricular . [8] Chi y col. (2008) utilizaron una línea de pez cebra GCaMP transgénica específica para el corazón para visualizar la activación de los cardiomiocitos a lo largo del ciclo cardíaco; a partir de sus resultados, caracterizaron cuatro etapas de desarrollo del sistema de conducción cardíaca del pez cebra e identificaron 17 mutaciones novedosas que afectan la conducción cardíaca. [34] Sin embargo, la expresión incontrolada de GCaMP conduce a la hipertrofia cardíaca debido a la sobreexpresión del motivo calmodulina, que interfiere con la señalización del calcio intracelular. Como resultado, los experimentos que utilizan tejido cardíaco deben controlar cuidadosamente el nivel de expresión de GCaMP. [8]
Activación de la vía de señalización
Dado que Ca 2+ es un segundo mensajero común, GCaMP se ha utilizado para monitorear la activación de vías de señalización. Por ejemplo, Bonder y McCarthy (2014) utilizaron GCaMP para mostrar que la señalización del receptor acoplado a proteína G astrocítica (GPCR) y la posterior liberación de Ca 2+ no eran responsables del acoplamiento neurovascular, el proceso por el cual los cambios en la actividad neuronal conducen a cambios en la el flujo de sangre. [35] Del mismo modo, Greer y Bear et al. (2016) utilizaron GCaMP para caracterizar la dinámica de la afluencia de Ca 2+ en la señalización de neuronas olfativas de collar , que utilizan proteínas transmembrana MS4A como quimiorreceptores . [36]
Ver también
- Imágenes de calcio
- Calcio en biología
- Calmodulina
- Camaleón (proteína)
- Proteína verde fluorescente
- Quinasa de cadena ligera de miosina
Referencias
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