Los vectores virales son herramientas comúnmente utilizadas por los biólogos moleculares para introducir material genético en las células . Este proceso se puede realizar dentro de un organismo vivo ( in vivo ) o en cultivo celular ( in vitro ). Los virus han desarrollado mecanismos moleculares especializados para transportar eficazmente sus genomas dentro de las células que infectan. La entrega de genes u otro material genético por un vector se denomina transducción y las células infectadas se describen como transducidas. Los biólogos moleculares utilizaron esta maquinaria por primera vez en la década de 1970. Paul Bergusó un virus SV40 modificado que contenía ADN del bacteriófago λ para infectar células de riñón de mono mantenidas en cultivo. [1]
Además de su uso en la investigación de biología molecular, los vectores virales se utilizan para la terapia génica y el desarrollo de vacunas .
Propiedades clave de un vector viral
Los vectores virales se adaptan a sus aplicaciones específicas, pero generalmente comparten algunas propiedades clave.
- Seguridad : aunque los vectores virales se crean ocasionalmente a partir de virus patógenos , se modifican de tal manera que se minimiza el riesgo de manipularlos. Esto generalmente implica la eliminación de una parte del genoma viral crítico para la replicación viral . Un virus de este tipo puede infectar células de forma eficaz pero, una vez que se ha producido la infección, requiere un virus auxiliar que proporcione las proteínas faltantes para la producción de nuevos viriones .
- Baja toxicidad : el vector viral debería tener un efecto mínimo sobre la fisiología de la célula que infecta.
- Estabilidad : algunos virus son genéticamente inestables y pueden reorganizar rápidamente sus genomas. Esto va en detrimento de la previsibilidad y reproducibilidad del trabajo realizado con un vector viral y se evita en su diseño.
- Especificidad del tipo de célula : la mayoría de los vectores virales están diseñados para infectar la mayor variedad posible de tipos de células . Sin embargo, a veces se prefiere lo contrario. El receptor viral se puede modificar para dirigir el virus a un tipo específico de célula. Los virus modificados de esta manera se denominan seudotipados .
- Identificación : Los vectores virales a menudo reciben ciertos genes que ayudan a identificar qué células tomaron los genes virales. Estos genes se denominan marcadores . Un marcador común es la resistencia a un determinado antibiótico. Entonces, las células pueden aislarse fácilmente, ya que aquellas que no han incorporado los genes del vector viral no tienen resistencia a los antibióticos y, por lo tanto, no pueden crecer en un cultivo con el antibiótico relevante presente.
Aplicaciones
Investigación básica
Los vectores virales se desarrollaron originalmente como una alternativa a la transfección de ADN desnudo para experimentos de genética molecular . En comparación con los métodos tradicionales de transfección (como la precipitación con fosfato de calcio ), la transducción puede garantizar que casi el 100% de las células se infecten sin afectar gravemente la viabilidad celular. [ cita requerida ] Además, algunos virus se integran en el genoma celular facilitando la expresión estable.
Los genes que codifican proteínas pueden expresarse usando vectores virales, comúnmente para estudiar la función de la proteína en particular. Los vectores virales, especialmente los retrovirus, que expresan de forma estable genes marcadores como GFP se utilizan ampliamente para marcar permanentemente las células para rastrearlas y su progenie, por ejemplo, en experimentos de xenotrasplante , cuando las células infectadas in vitro se implantan en un animal huésped.
La inserción de genes , que se puede realizar con vectores virales, es más barata de realizar que la eliminación de genes . Pero como el silenciamiento de genes , un efecto que puede preverse con la inserción de genes, a veces no es específico y tiene efectos fuera del objetivo en otros genes, por lo tanto, proporciona resultados menos confiables. Los vectores animales hospedadores también juegan un papel importante [ aclaración necesaria ] .
Terapia de genes
La terapia genética es una técnica para corregir genes defectuosos responsables del desarrollo de enfermedades. En el futuro, la terapia génica puede proporcionar una manera de curar trastornos genéticos , tales como la inmunodeficiencia combinada grave , fibrosis quística o incluso A hemofilia . Debido a que estas enfermedades son el resultado de mutaciones en la secuencia de ADN de genes específicos, los ensayos de terapia génica han utilizado virus para entregar copias no mutadas de estos genes a las células del cuerpo del paciente. Ha habido una gran cantidad de éxitos de laboratorio con la terapia génica. Sin embargo, se deben superar varios problemas de la terapia génica viral antes de que gane un uso generalizado. La respuesta inmune a los virus no solo impide la entrega de genes a las células diana, sino que puede causar graves complicaciones al paciente. En uno de los primeros ensayos de terapia génica en 1999, esto llevó a la muerte de Jesse Gelsinger , quien fue tratado con un vector adenoviral. [2]
Algunos vectores virales, por ejemplo los gamma-retrovirus , insertan sus genomas en una ubicación aparentemente aleatoria en uno de los cromosomas del huésped , lo que puede alterar la función de los genes celulares y provocar cáncer. En un ensayo de terapia génica retroviral de inmunodeficiencia combinada grave realizado en 2002, cuatro de los pacientes desarrollaron leucemia como consecuencia del tratamiento; [3] tres de los pacientes se recuperaron después de la quimioterapia. [4] Los vectores basados en virus adenoasociados son mucho más seguros a este respecto, ya que siempre se integran en el mismo sitio del genoma humano, con aplicaciones en diversos trastornos, como la enfermedad de Alzheimer . [5]
Vacunas
Una vacuna de vector vivo es una vacuna que usa un organismo (típicamente virus o bacteria) que no causa la enfermedad para transportar los genes del patógeno al cuerpo para estimular una respuesta inmune . [6] Actualmente se están desarrollando virus que expresan proteínas patógenas como vacunas contra estos patógenos, basándose en el mismo fundamento que las vacunas de ADN . Los genes usados en tales vacunas son normalmente proteínas de superficie que codifican antígenos del organismo patógeno . Luego se insertan en el genoma de un organismo no patógeno, donde se expresan en la superficie del organismo y pueden provocar una respuesta inmune. [ aclaración necesaria ]
A diferencia de las vacunas atenuadas , las vacunas de vectores virales carecen de otros genes patógenos necesarios para la replicación, por lo que la infección por el patógeno es imposible. Los adenovirus se están desarrollando activamente como vectores de vacunas.
Entrega de medicamentos
Una cepa del virus de la viruela del canario modificada para transportar interleucina-2 felina se usa para tratar gatos con fibrosarcoma . [7]
Tipos
Retrovirus
Los retrovirus son uno de los pilares de los enfoques actuales de la terapia génica. Los retrovirus recombinantes, como el virus de la leucemia murina de Moloney, tienen la capacidad de integrarse en el genoma del huésped de forma estable. Contienen una transcriptasa inversa para hacer una copia de ADN del genoma de ARN y una integrasa que permite la integración en el genoma del huésped . Se han utilizado en varios ensayos clínicos aprobados por la FDA, como el ensayo SCID-X1 . [8]
Los vectores retrovirales pueden ser competentes para la replicación o defectuosos para la replicación. Los vectores de replicación defectuosa son la opción más común en los estudios porque los virus han tenido las regiones codificantes de los genes necesarios para rondas adicionales de replicación y empaquetamiento del virión reemplazadas con otros genes, o eliminadas. Estos virus son capaces de infectar sus células diana y entregar su carga viral, pero luego no continúan con la ruta lítica típica que conduce a la lisis y muerte celular.
Por el contrario, los vectores virales con capacidad de replicación contienen todos los genes necesarios para la síntesis de viriones y continúan propagándose una vez que se produce la infección. Debido a que el genoma viral para estos vectores es mucho más largo, la longitud del gen de interés insertado real es limitada en comparación con la longitud posible del inserto para los vectores de replicación defectuosa. Dependiendo del vector viral, la longitud máxima típica de un inserto de ADN permitido en un vector viral con replicación defectuosa suele ser de unos 8 a 10 kB. [ verificación necesaria ] [9] Si bien esto limita la introducción de muchas secuencias genómicas, la mayoría de las secuencias de ADNc aún se pueden acomodar.
El principal inconveniente del uso de retrovirus tales como el retrovirus de Moloney implica el requisito de que las células se dividan activamente para la transducción . Como resultado, las células como las neuronas son muy resistentes a la infección y transducción por retrovirus.
Existe la preocupación de que la mutagénesis de inserción debida a la integración en el genoma del huésped pueda provocar cáncer o leucemia . Esta preocupación siguió siendo teórica hasta que la terapia génica para diez pacientes con SCID-X1 que usaban el virus de la leucemia murina de Moloney [10] resultó en dos casos de leucemia causada por la activación del oncogén LMO2 debido a la integración cercana del vector. [11]
Lentivirus
Los lentivirus son una subclase de retrovirus. A veces se utilizan como vectores para la terapia génica gracias a su capacidad para integrarse en el genoma de las células que no se dividen, que es la característica única de los lentivirus, ya que otros retrovirus solo pueden infectar células en división. El genoma viral en forma de ARN se transcribe inversamente cuando el virus ingresa a la célula para producir ADN , que luego se inserta en el genoma en una posición aleatoria (hallazgos recientes sugieren que la inserción de ADN viral no es aleatoria sino dirigida a genes activos específicos y relacionados con la organización del genoma [12] ) por la enzima integrasa viral . El vector, ahora llamado provirus , permanece en el genoma y se transmite a la progenie de la célula cuando se divide. Hasta el momento, no existen técnicas para determinar el sitio de integración, lo que puede plantear un problema. El provirus puede alterar la función de los genes celulares y provocar la activación de oncogenes que promueven el desarrollo del cáncer , lo que plantea preocupaciones sobre posibles aplicaciones de los lentivirus en la terapia génica. Sin embargo, los estudios han demostrado que los vectores lentivirus tienen una menor tendencia a integrarse en lugares que potencialmente causan cáncer que los vectores gamma-retrovirales. [13] Más específicamente, un estudio encontró que los vectores lentivirales no causaron ni un aumento en la incidencia de tumores ni una aparición más temprana de tumores en una cepa de ratón con una incidencia mucho mayor de tumores. [14] Además, los ensayos clínicos que utilizaron vectores lentivirales para administrar terapia génica para el tratamiento del VIH no experimentaron un aumento en los eventos mutagénicos u oncológicos. [15]
Por razones de seguridad, los vectores lentivirales nunca portan los genes necesarios para su replicación. Para producir un lentivirus, se transfectan varios plásmidos en una denominada línea celular de empaquetamiento , comúnmente HEK 293 . Uno o más plásmidos, generalmente denominados plásmidos de empaquetamiento, codifican las proteínas del virión , como la cápside y la transcriptasa inversa . Otro plásmido contiene el material genético que será entregado por el vector. Se transcribe para producir el genoma viral de ARN monocatenario y está marcado por la presencia de la secuencia ψ (psi). Esta secuencia se utiliza para empaquetar el genoma en el virión.
Adenovirus
A diferencia de los lentivirus, el ADN adenoviral no se integra en el genoma y no se replica durante la división celular. Esto limita su uso en la investigación básica, aunque los vectores adenovirales todavía se utilizan en experimentos in vitro e in vivo . [16] Sus principales aplicaciones son la terapia génica y la vacunación . Dado que los seres humanos comúnmente entran en contacto con adenovirus , que causan infecciones respiratorias, gastrointestinales y oculares, la mayoría de los pacientes ya han desarrollado anticuerpos neutralizantes que pueden inactivar el virus antes de que llegue a la célula diana. Para superar este problema, los científicos están investigando adenovirus que infectan diferentes especies a las que los humanos no tienen inmunidad, por ejemplo, el adenovirus de chimpancé que se utiliza como vector para transportar el gen pico del SARS-CoV-2 en la vacuna COVID de Oxford AstraZeneca.
Virus adenoasociados
El virus adenoasociado (AAV) es un virus pequeño que infecta a los seres humanos y algunas otras especies de primates. Actualmente, no se sabe que el AAV cause enfermedades y provoca una respuesta inmunitaria muy leve. El AAV puede infectar tanto células en división como células que no se dividen y puede incorporar su genoma al de la célula huésped. Además, el VAA permanece principalmente como episomal (se replica sin incorporarse al cromosoma); realizando una expresión larga y estable. [17] Estas características hacen que el AAV sea un candidato muy atractivo para crear vectores virales para terapia génica. [1] Sin embargo, AAV solo puede traer hasta 5kb, que es considerablemente pequeño en comparación con la capacidad original de AAV. [17]
Además, debido a su uso potencial como vector de terapia génica, los investigadores han creado un AAV alterado llamado virus adenoasociado autocomplementario (scAAV). Mientras que el AAV empaqueta una sola hebra de ADN y requiere el proceso de síntesis de la segunda hebra, el scAAV empaqueta ambas hebras que se hibridan para formar ADN bicatenario. Al omitir la síntesis de la segunda cadena, el scAAV permite una rápida expresión en la célula. [18] De lo contrario, scAAV tiene muchas características de su homólogo AAV.
Virus de plantas
Los virus de plantas se pueden utilizar para diseñar vectores virales , herramientas que se utilizan habitualmente para introducir material genético en células vegetales ; también son fuentes de biomateriales y dispositivos de nanotecnología. [19] [20] El virus del mosaico del tabaco (TMV) es el primer virus en ser descubierto. Los vectores virales basados en el virus del mosaico del tabaco incluyen los de las tecnologías de expresión de plantas magnICON [21] y TRBO. [19]
Híbridos
Los vectores híbridos son virus vectoriales que se diseñan genéticamente para tener cualidades de más de un vector. Los virus se modifican para evitar las deficiencias de los vectores virales típicos, que pueden tener una capacidad de carga, inmunogenicidad, genotoxicidad limitadas y no pueden soportar una expresión transgénica adecuada a largo plazo . Mediante la sustitución de elementos indeseables por las capacidades deseadas, los vectores híbridos pueden superar en el futuro a los vectores de transfección estándar en términos de seguridad y eficacia terapéutica. [22]
Desafíos en la aplicación
La elección de un vector viral para entregar material genético a las células conlleva algunos problemas logísticos. Hay un número limitado de vectores virales disponibles para uso terapéutico. Cualquiera de estos pocos vectores virales puede hacer que el cuerpo desarrolle una respuesta inmune si el vector se ve como un invasor extraño. [23] [24] Una vez utilizado, el vector viral no puede volver a utilizarse eficazmente en el paciente porque el organismo lo reconocerá. Si la vacuna o la terapia génica fracasan en los ensayos clínicos , el virus no se puede volver a usar en el paciente para una vacuna o terapia génica diferente en el futuro.
La inmunidad preexistente contra el vector viral también podría estar presente en el paciente, haciendo que la terapia sea ineficaz para ese paciente. [23] [25] Debido a que el cebado con una vacuna de ADN desnudo y el refuerzo con un vector viral dan como resultado una respuesta inmune robusta a través de mecanismos aún indefinidos, a pesar de la inmunidad del vector viral preexistente, esta estrategia de vacunación puede contrarrestar este problema. [26] Sin embargo, este método puede presentar otro gasto y obstáculo en el proceso de distribución de la vacuna. La inmunidad preexistente también puede desafiarse aumentando la dosis de vacuna o cambiando la ruta de vacunación . [27]
Algunas deficiencias de los vectores virales (como la genotoxicidad y la baja expresión transgénica) pueden superarse mediante el uso de vectores híbridos .
Ver también
- Transformación viral
Referencias
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