Knockdown de genes es una técnica experimental por el cual la expresión de uno o más de un organismo 's genes se reduce. La reducción puede ocurrir por modificación genética o por tratamiento con un reactivo tal como un oligonucleótido corto de ADN o ARN que tiene una secuencia complementaria al gen o una transcripción de ARNm. [1]
Versus caída transitoria
Si el ADN de un organismo se modifica genéticamente, el organismo resultante se denomina "organismo destructor". Si el cambio en la expresión génica se debe a que un oligonucleótido se une a un ARNm o se une temporalmente a un gen , esto conduce a un cambio temporal en la expresión génica que no modifica el ADN cromosómico, y el resultado se denomina "caída transitoria ". [1]
En una caída transitoria, la unión de este oligonucleótido al gen activo o sus transcripciones provoca una expresión disminuida a través de una variedad de procesos. La unión puede ocurrir a través del bloqueo de la transcripción (en el caso de la unión de genes), la degradación de la transcripción del ARNm (por ejemplo, por ARN interferente pequeño ( ARNip )) o antisentido dependiente de ARNasa -H, o mediante el bloqueo de la traducción del ARNm , sitios de corte y empalme de ARN pre-m , o sitios de corte por nucleasa usados para la maduración de otros ARN funcionales, incluyendo miARN (por ejemplo, por oligos morfolino u otros antisentido independientes de ARNasa-H). [1] [2]
El uso más directo de las caídas transitorias es para aprender sobre un gen que ha sido secuenciado , pero tiene una función desconocida o incompleta. Este enfoque experimental se conoce como genética inversa . Los investigadores extraen inferencias de cómo el derribo difiere de los individuos en los que el gen de interés está operativo. Las caídas transitorias se utilizan a menudo en biología del desarrollo porque los oligos se pueden inyectar en cigotos unicelulares y estarán presentes en las células hijas de la célula inyectada a través del desarrollo embrionario . [3] El término eliminación de genes apareció por primera vez en la literatura en 1994 [4]
Interferencia de ARN
La interferencia de ARN (ARNi) es un medio para silenciar genes mediante la degradación del ARNm. [5] La eliminación de genes mediante este método se logra mediante la introducción de pequeños ARN interferentes bicatenarios (ARNip) en el citoplasma. Los ARN de interferencia pequeños pueden originarse desde el interior de la célula o pueden introducirse exógenamente en la célula. Una vez introducidos en la célula, los ARNip exógenos son procesados por el complejo silenciador inducido por ARN ( RISC ). [6] El ARNip es complementario del ARNm diana que se va a silenciar, y el RISC utiliza el ARNip como plantilla para localizar el ARNm diana. Después de que el RISC se localiza en el ARNm diana, el ARN es escindido por una ribonucleasa.
El ARNi se utiliza ampliamente como técnica de laboratorio para el análisis funcional genético. [7] El ARNi en organismos como C. elegans y Drosophila melanogaster proporciona un medio rápido y económico de investigar la función de los genes. En la investigación de C. elegans , la disponibilidad de herramientas como la biblioteca Ahringer RNAi proporciona a los laboratorios una forma de probar muchos genes en una variedad de antecedentes experimentales. Los conocimientos adquiridos a partir del uso experimental de ARNi pueden ser útiles para identificar posibles dianas terapéuticas, desarrollo de fármacos u otras aplicaciones. [8] La interferencia de ARN es una herramienta de investigación muy útil, que permite a los investigadores realizar grandes cribados genéticos en un esfuerzo por identificar objetivos para futuras investigaciones relacionadas con una vía, fármaco o fenotipo en particular. [9] [10]
CRISPR
Un medio diferente de silenciar el ADN exógeno que se ha descubierto en procariotas es un mecanismo que involucra loci llamados 'Repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas', o CRISPR . [11] Los genes asociados a CRISPR (cas) codifican la maquinaria celular que corta el ADN exógeno en pequeños fragmentos y los inserta en un locus de repetición CRISPR. Cuando esta región CRISPR de ADN es expresada por la célula, los ARN pequeños producidos a partir de los insertos de ADN exógeno sirven como una secuencia molde que otras proteínas Cas utilizan para silenciar esta misma secuencia exógena. Las transcripciones de las secuencias exógenas cortas se utilizan como guía para silenciar estos ADN extraño cuando están presentes en la célula. Esto sirve como una especie de inmunidad adquirida, y este proceso es como un mecanismo de interferencia de ARN procariótico. Las repeticiones CRISPR se conservan entre muchas especies y se ha demostrado que se pueden utilizar en células humanas, [12] bacterias, [13] C. elegans , [14] pez cebra , [15] y otros organismos para una manipulación eficaz del genoma. El uso de CRISPR como una herramienta de investigación versátil puede ilustrarse [16] por muchos estudios que lo utilizan para generar organismos con alteraciones del genoma.
TALENs
Otra tecnología que es posible gracias a la manipulación del genoma procariótico es el uso de nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción ( TALEN ) para apuntar a genes específicos. [17] Las TALEN son nucleasas que tienen dos componentes funcionales importantes: un dominio de unión al ADN y un dominio de escisión del ADN. El dominio de unión al ADN es una secuencia efectora de tipo activador de la transcripción específica de secuencia, mientras que el dominio de escisión del ADN se origina a partir de una endonucleasa bacteriana y no es específico. Los TALEN pueden diseñarse para escindir una secuencia especificada por la secuencia de la parte efectora de tipo activador de la transcripción de la construcción. Una vez diseñado, un TALEN se introduce en una célula como plásmido o ARNm. El TALEN se expresa, se localiza en su secuencia diana y escinde un sitio específico. Después de la escisión de la secuencia de ADN diana por el TALEN, la célula utiliza la unión de extremos no homólogos como mecanismo de reparación del ADN para corregir la escisión. El intento de la célula de reparar la secuencia escindida puede hacer que la proteína codificada no sea funcional, ya que este mecanismo de reparación introduce errores de inserción o deleción en el sitio reparado.
Comercialización
Hasta ahora, los organismos derribados con alteraciones permanentes en su ADN se han diseñado principalmente con fines de investigación. También conocidos simplemente como derribos , estos organismos se utilizan más comúnmente para la genética inversa, especialmente en especies como ratones o ratas para las que no se pueden aplicar fácilmente tecnologías de derribo transitorio. [3] [18]
Hay varias empresas que ofrecen servicios comerciales relacionados con los tratamientos de eliminación de genes.
Ver también
- Nocaut genético
Referencias
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enlaces externos
- "Recursos de ingeniería del genoma CRISPR" . Instituto Broad.
- "Mojo Hand: diseña tus propios TALEN" . La Clínica Mayo.
- "TALEN Effector Nucleotide Targeter 2.0" . Universidad de Cornell.