El complejo de silenciamiento inducido por ARN , o RISC , es un complejo multiproteico , específicamente una ribonucleoproteína , que funciona en el silenciamiento de genes a través de una variedad de vías a nivel transcripcional y traduccional. [1] Usando fragmentos de ARN monocatenario (ssRNA), como microARN (miARN), o ARN interferente pequeño bicatenario (ARNip), el complejo funciona como una herramienta clave en la regulación génica. [2] La hebra única de ARN actúa como plantilla para que RISC reconozca la transcripción del ARN mensajero complementario (ARNm).. Una vez encontrada, una de las proteínas en RISC, Argonaute , activa y escinde el ARNm. Este proceso se denomina interferencia de ARN (ARNi) y se encuentra en muchos eucariotas ; es un proceso clave en la defensa contra infecciones virales , ya que se desencadena por la presencia de ARN bicatenario (dsRNA). [3] [4] [1]
Descubrimiento
La identificación bioquímica de RISC fue realizada por Gregory Hannon y sus colegas en el Laboratorio Cold Spring Harbor . [5] Esto fue solo un par de años después del descubrimiento de la interferencia de ARN en 1998 por Andrew Fire y Craig Mello , quienes compartieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 2006 . [3]
Hannon y sus colegas intentaron identificar los mecanismos de ARNi implicados en el silenciamiento de genes , mediante dsRNA, en células de Drosophila . Se transfectaron células de Drosophila S2 con un vector de expresión lacZ para cuantificar la expresión génica con actividad de β-galactosidasa . Sus resultados mostraron que la cotransfección con lacZ dsRNA redujo significativamente la actividad de la β-galactosidasa en comparación con el control de dsRNA. Por tanto, los dsRNA controlan la expresión génica mediante la complementariedad de secuencias .
A continuación, las células S2 se transfectaron con dsRNA de ciclina E de Drosophila . Ciclina E es un gen esencial para el ciclo celular progresión en la fase S . El dsRNA de ciclina E detuvo el ciclo celular en la fase G 1 (antes de la fase S). Por lo tanto, el ARNi puede dirigirse a genes endógenos .
Además, el dsRNA de ciclina E solo disminuyó el RNA de ciclina E; también se mostró un resultado similar usando el dsRNA correspondiente a la ciclina A que actúa en las fases S, G 2 y M del ciclo celular. Esto muestra el sello característico de RNAi: los niveles reducidos de mRNAs corresponden a los niveles de dsRNA añadidos.
Para probar si su observación de niveles de ARNm disminuidos era el resultado de que el ARNm se dirigiera directamente (como lo sugieren los datos de otros sistemas), las células Drosophila S2 se transfectaron con ARNbc de ciclina E de Drosophila o ARNdc lacZ y luego se incubaron con ARNm sintéticos para ciclina E o lacZ .
Las células transfectadas con dsRNA de ciclina E solo mostraron degradación en las transcripciones de ciclina E; las transcripciones de lacZ eran estables. Por el contrario, las células transfectadas con dsRNA de lacZ solo mostraron degradación en las transcripciones de lacZ y no en las transcripciones de ciclina E. Sus resultados llevaron a Hannon y sus colegas a sugerir que el ARNi degrada el ARNm diana a través de una " actividad nucleasa específica de secuencia ". Llamaron a la enzima nucleasa RISC. [5]
Función en la interferencia de ARN
Incorporación de ARNip / miARN
El RNase III Dicer es un miembro crítico de RISC que inicia el proceso de interferencia del ARN produciendo ARNip bicatenario o miARN monocatenario. La escisión enzimática del dsRNA dentro de la célula produce fragmentos cortos de siRNA de 21-23 nucleótidos de longitud con un saliente 3 'de dos nucleótidos . [6] [7] Dicer también procesa pre-miRNA, que forma una estructura de bucle de horquilla para imitar el dsRNA, de manera similar. Los fragmentos de dsRNA se cargan en RISC y cada hebra tiene un destino diferente según el fenómeno de la regla de asimetría, la selección de una hebra como hebra guía sobre la otra se basa en la estabilidad termodinámica. [8] [9] [10] [11] Los miRNA o siRNA recién generados actúan como secuencias guía monocatenarias para que RISC apunte al mRNA para su degradación. [12] [13]
- La hebra con el extremo 5 ' menos termodinámicamente estable es seleccionada por la proteína Argonaute y se integra en RISC. [11] [14] Esta hebra se conoce como la hebra guía y se dirige al ARNm para su degradación.
- La otra hebra, conocida como la hebra del pasajero, es degradada por RISC. [15]
Regulación genética
Las principales proteínas de RISC, Ago2, SND1 y AEG-1 actúan como contribuyentes cruciales a la función de silenciamiento génico del complejo. [dieciséis]
RISC utiliza la hebra guía de miARN o ARNip para dirigirse a regiones complementarias 3 'no traducidas (3'UTR) de transcripciones de ARNm a través del emparejamiento de bases de Watson-Crick , lo que le permite regular la expresión génica de la transcripción de ARNm de varias formas. [17] [1]
degradación del ARNm
La función más conocida de RISC es el ARNm diana de degradación que reduce los niveles de transcripción disponibles para ser traducidos por los ribosomas . La escisión endonucleolítica del ARNm complementario a la cadena guía de RISC por la proteína Argonaute es la clave para la iniciación del ARNi. [18] Hay dos requisitos principales para que se produzca la degradación del ARNm:
- una coincidencia complementaria casi perfecta entre la hebra guía y la secuencia de ARNm diana, y
- una proteína Argonaute catalíticamente activa, llamada "cortadora", para escindir el ARNm diana. [1]
Hay dos vías principales de degradación del ARNm una vez que se ha producido la escisión. Ambos se inician mediante la degradación de la cola poli (A) del ARNm, lo que da como resultado la eliminación de la capa 5 'del ARNm.
- 5 'a 3' degradación de la transcripción se produce por XRN1 exonucleasa en citoplasmáticos cuerpos llamados P-cuerpos . [19]
- La degradación de 3 'a 5' de la transcripción es realizada por el exosoma y el complejo Ski . [18]
Represión traslacional
RISC puede modular la carga de ribosoma y factores accesorios en la traducción para reprimir la expresión del transcrito de ARNm unido. La represión traslacional solo requiere una coincidencia de secuencia parcial entre la hebra guía y el ARNm diana. [1]
La traducción se puede regular en el paso inicial mediante:
- impidiendo la unión del factor de iniciación de la traducción eucariota (eIF) a la tapa 5 ' . Se ha observado que RISC puede amortiguar la cola de poli (A) 3 ' que podría contribuir a la represión a través de la tapa 5'. [2] [17]
- la prevención de la unión de la subunidad ribosómica 60S que se une al ARNm puede reprimir la traducción. [20]
La traducción se puede regular en los pasos posteriores al inicio mediante:
- degradación de péptidos,
- promover la terminación prematura de los ribosomas de traducción, [21] o,
- retardando el alargamiento. [22]
Todavía se especula sobre si la represión traslacional vía iniciación y post-iniciación es mutuamente excluyente.
Formación de heterocromatina
Algunas RISC pueden apuntar directamente al genoma reclutando histonas metiltransferasas para formar heterocromatina en el locus del gen , silenciando el gen. Estos RISC toman la forma de un complejo de silenciamiento transcripcional inducido por ARN (RITS). El ejemplo mejor estudiado es la levadura RITS. [1] [23] [24]
Se ha demostrado que RITS dirige la formación de heterocromatina en los centrómeros mediante el reconocimiento de repeticiones centroméricas. A través del emparejamiento de bases de ARNip (cadena guía) con secuencias de cromatina diana, se pueden reclutar enzimas modificadoras de histonas. [25]
El mecanismo no se comprende bien; sin embargo, los RITS degradan las transcripciones de ARNm nacientes. Se ha sugerido que este mecanismo actúa como un " bucle de retroalimentación autorreforzado ", ya que las transcripciones nacientes degradadas son utilizadas por la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp) para generar más ARNip. [26]
En Schizosaccharomyces pombe y Arabidopsis , el procesamiento de dsRNA ds en siRNA por Dicer RNases puede iniciar una vía de silenciamiento de genes mediante la formación de heterocromatina. Una proteína argonauta conocida como AGO4 interactúa con los ARN pequeños que definen las secuencias heterocromáticas. Una histona metil transferasa (HMT), H3K9 , metila la histona H3 y recluta proteínas de cromodominio en los sitios de metilación. La metilación del ADN mantiene el silenciamiento de genes a medida que las secuencias de heterocromatina pueden establecerse o propagarse. [27]
Eliminación de ADN
El ARNip generado por los RISC parece tener un papel en la degradación del ADN durante el desarrollo del macronúcleo somático en los protozoos Tetrahymena . Es similar al control epigenético de la formación de heterocromatina y está implícito como defensa contra elementos genéticos invasores. [27]
Similar a la formación de heterocromatina en S. pombe y Arabidopsis , una proteína de Tetrahymena relacionada con la familia Argonaute, Twi1p, cataliza la eliminación del ADN de secuencias diana conocidas como secuencias de eliminación interna (IES). Utilizando metiltransferasas y proteínas de cromodominio, las IES se heterocromatizan y se eliminan del ADN. [27]
Proteínas asociadas a RISC
La estructura completa de RISC aún está sin resolver. Muchos estudios han informado una variedad de tamaños y componentes para RISC, pero no es del todo seguro si esto se debe a que existen varios complejos RISC o debido a las diferentes fuentes que utilizan los diferentes estudios. [28]
Complejo | Fuente | Componentes conocidos / aparentes | Tamaño estimado | Función aparente en la vía del ARNi |
---|---|---|---|---|
Dcr2-R2D2 [29] | Células de D. melanogaster S2 | Dcr2 , R2D2 | ~ 250 kDa | procesamiento de dsRNA, unión de siRNA |
RLC (A) [30] [31] | Embriones de D. melanogaster | Dcr2, R2D2 | NR | procesamiento de dsRNA, unión de siRNA, precursor de RISC |
Holo-RISC [30] [31] | Embriones de D. melanogaster | Hace 2 , Dcr1, Dcr2, Fmr1 / Fxr , R2D2, Tsn , Vig | ~ 80S | Unión y escisión del ARN objetivo |
RISC [5] [32] [33] [34] | Células de D. melanogaster S2 | Hace2, Fmr1 / Fxr, Tsn, Vig | ~ 500 kDa | Unión y escisión del ARN objetivo |
RISC [35] | Células de D. melanogaster S2 | Hace2 | ~ 140 kDa | Unión y escisión del ARN objetivo |
Complejo asociado a Fmr1 [36] | Células de D. melanogaster S2 | L5 , L11 , ARNr 5S , Fmr1 / Fxr, Ago2, Dmp68 | NR | Posible unión y escisión del ARN diana |
RISC mínimo [37] [38] [39] [40] | Células HeLa | eIF2C1 (Ago1) o eIF2C2 (Ago2) | ~ 160 kDa | Unión y escisión del ARN objetivo |
miRNP [41] [42] | Células HeLa | eIF2C2 (ago2), Gemin3 , Gemin4 | ~ 550 kDa | Asociación de miARN, unión y escisión de ARN diana |
Hace, Argonaute; Dcr, Dicer; Dmp68, ortólogo de D. melanogaster de unwindase de ARN p68 de mamífero; eIF2C1, factor de iniciación de la traducción eucariota 2C1; eIF2C2, factor de iniciación de la traducción eucariota 2C2; Fmr1 / Fxr, ortólogo de D. melanogaster de la proteína de retraso mental X frágil; miRNP, complejo miARN-proteína; NR, no informado; Tsn, nucleasa Tudor-estafilocócica; Vig, gen intrónico vasa.
Independientemente, es evidente que las proteínas Argonaute están presentes y son esenciales para su función. Además, existen conocimientos sobre algunas de las proteínas clave (además de Argonaute) dentro del complejo, que permiten que RISC lleve a cabo su función.
Proteínas argonauta
Las proteínas argonauta son una familia de proteínas que se encuentran en procariotas y eucariotas. Se desconoce su función en procariotas, pero en eucariotas son responsables de ARNi. [43] Hay ocho miembros de la familia en Argonautes humanos de los cuales solo Argonaute 2 está involucrado exclusivamente en la escisión de ARN dirigida en RISC. [40]
Complejo de carga RISC
El complejo de carga de RISC (RLC) es la estructura esencial necesaria para cargar fragmentos de dsRNA en RISC para apuntar al mRNA. El RLC consta de dicer, la proteína de unión al ARN de respuesta transactivante ( TRBP ) y Argonaute 2.
- Dicer es una endonucleasa de ARNasa III que genera los fragmentos de ARNds que se cargan que dirigen ARNi.
- TRBP es una proteína con tres dominios de unión a ARN bicatenarios .
- Argonaute 2 es una RNasa y es el centro catalítico de RISC.
Dicer se asocia con TRBP y Argonaute 2 para facilitar la transferencia de los fragmentos de dsRNA generados por Dicer a Argonaute 2. [44] [45]
Investigaciones más recientes han demostrado que la helicasa A de ARN humana podría ayudar a facilitar la RLC. [46]
Otras proteinas
Los miembros recientemente identificados de RISC son SND1 y MTDH . [47] SND1 y MTDH son oncogenes y regulan la expresión de varios genes. [48]
Proteína | Especies en las que se encuentra la proteína |
---|---|
Dcr1 [30] | D. melanogaster |
Dcr2 [29] [30] [31] | D. melanogaster |
R2D2 [30] [31] | D. melanogaster |
Hace 2 [30] [32] [35] [36] | D. melanogaster |
Dmp68 [36] | D. melanogaster |
Fmr1 / Fxr [30] [33] [36] | D. melanogaster |
Tsn [30] [34] | D. melanogaster |
Vig [30] [33] | D. melanogaster |
Polirribosomas , componentes de ribosomas [5] [30] [32] [36] [49] | D. melanogaster , T. brucei |
eIF2C1 (Ago1) [37] | H. sapiens |
eIF2C2 (Ago2) [37] [38] [40] [42] | H. sapiens |
Gémin3 [41] [42] | H. sapiens |
Gémin4 [41] [42] | H. sapiens |
Hace, Argonaute; Dcr, Dicer; Dmp68, ortólogo de D. melanogaster de unwindase de ARN p68 de mamífero; eIF2C1, factor de iniciación de la traducción eucariota 2C1; eIF2C2, factor de iniciación de la traducción eucariota 2C2; Fmr1 / Fxr, ortólogo de D. melanogaster de la proteína de retraso mental X frágil; Tsn, nucleasa Tudor-estafilocócica; Vig, gen intrónico vasa.
Unión de ARNm
Aún no está claro cómo el complejo RISC activado localiza los objetivos de ARNm en la célula, aunque se ha demostrado que el proceso puede ocurrir en situaciones fuera de la traducción de proteínas en curso a partir de ARNm. [50]
El miARN expresado de forma endógena en los metazoos no suele ser perfectamente complementario a un gran número de genes y, por tanto, modulan la expresión a través de la represión traduccional. [51] [52] Sin embargo, en las plantas , el proceso tiene una especificidad mucho mayor para atacar el ARNm y, por lo general, cada miARN solo se une a un ARNm. Una mayor especificidad significa que es más probable que ocurra la degradación del ARNm. [53]
Ver también
- Silenciamiento transcripcional inducido por ARN (RITS)
- Interferencia de ARN
Referencias
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Otras lecturas
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- Fu Q, Yuan YA (marzo de 2013). "Conocimientos estructurales en el ensamblaje de RISC facilitado por dominios de unión de dsRNA de helicasa A de ARN humano (DHX9)" . Investigación de ácidos nucleicos . 41 (5): 3457–70. doi : 10.1093 / nar / gkt042 . PMC 3597700 . PMID 23361462 .
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enlaces externos
- Complejo + silenciador + inducido por ARN en los encabezados de temas médicos (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU .