Un morfolino , también conocido como oligómero morfolino y como oligómero morfolino fosforodiamidato (PMO), es un tipo de molécula oligomérica (coloquialmente, un oligo ) que se utiliza en biología molecular para modificar la expresión génica . Su estructura molecular contiene bases de ADN unidas a una columna vertebral de anillos de metilenmorfolina unidos a través de grupos fosforodiamidato . Los morfolinos bloquean el acceso de otras moléculas a secuencias específicas pequeñas (~ 25 bases) de las superficies de apareamiento de bases del ácido ribonucleico (ARN). Los morfolinos se utilizan como herramientas de investigación para la genética inversa.por derribando la función génica.
Este artículo analiza solo los oligómeros antisentido de Morfolino, que son análogos de ácido nucleico . La palabra "Morfolino" puede aparecer en otros nombres químicos, refiriéndose a sustancias químicas que contienen un anillo de morfolina de seis miembros . Para ayudar a evitar la confusión con otras moléculas que contienen morfolina, cuando se describen oligos, "Morfolino" se escribe con mayúscula como nombre comercial , pero este uso no es coherente en la literatura científica. Los oligos morfolino a veces se denominan PMO (para oligómero morfolino fosforodiamidato), especialmente en la literatura médica. Vivo-Morfolinos y PPMO son formas modificadas de Morfolinos con grupos químicos unidos covalentemente para facilitar la entrada en las células.
La eliminación de genes se logra reduciendo la expresión de un gen particular en una célula. En el caso de genes que codifican proteínas, esto generalmente conduce a una reducción en la cantidad de la proteína correspondiente en la célula. Derribar la expresión génica es un método para aprender sobre la función de una proteína en particular; De manera similar, hacer que un exón específico se corte y empalme del transcrito de ARN que codifica una proteína puede ayudar a determinar la función del resto de proteína codificado por ese exón o, a veces, puede anular la actividad de la proteína por completo. Estas moléculas se han aplicado a estudios en varios organismos modelo , incluidos ratones , peces cebra , ranas y erizos de mar . [1] Los morfolinos también pueden modificar el empalme de pre-mRNA [2] o inhibir la maduración y la actividad de miRNA. [3] Recientemente se han revisado en un artículo de revista [4] y en forma de libro técnicas para dirigir morfolinos a ARN y administrar morfolinos a las células . [5]
Los morfolinos están en desarrollo como terapias farmacéuticas dirigidas contra organismos patógenos como bacterias [6] o virus [7] y enfermedades genéticas . [8] Un fármaco a base de morfolino eteplirsen de Sarepta Therapeutics recibió la aprobación acelerada de la Administración de Drogas y Alimentos de EE. UU. En septiembre de 2016 para el tratamiento de algunas mutaciones que causan distrofia muscular de Duchenne , [9] aunque el proceso de aprobación estuvo envuelto en controversias. Otro fármaco a base de morfolino, golodirsen (también para la distrofia muscular de Duchenne) fue aprobado por la FDA en diciembre de 2019 [10].
Historia
Los oligos morfolino fueron concebidos por Summerton ( Gene Tools ) en AntiVirals Inc. (ahora Sarepta Therapeutics) y originalmente desarrollados en colaboración con Weller. [11]
Estructura
Los morfolinos son moléculas sintéticas que son el producto de un rediseño de la estructura natural del ácido nucleico . [12] Por lo general, de 25 bases de longitud, se unen a secuencias complementarias de ARN o ADN monocatenario mediante emparejamiento de bases de ácido nucleico estándar . En términos de estructura, la diferencia entre los morfolinos y el ADN es que, mientras que los morfolinos tienen bases de ácido nucleico estándar, esas bases están unidas a anillos de metilen morfolina unidos a través de grupos fosforodiamidato en lugar de fosfatos . [12] La figura compara las estructuras de las dos hebras representadas allí, una de ARN y la otra de Morfolino. El reemplazo de los fosfatos aniónicos con los grupos fosforodiamidato sin carga elimina la ionización en el rango de pH fisiológico habitual , por lo que los morfolinos en organismos o células son moléculas sin carga. Toda la columna vertebral de un Morpholino está hecha de estas subunidades modificadas.
Función
Los morfolinos no desencadenan la degradación de sus moléculas de ARN diana, a diferencia de muchos tipos estructurales antisentido (p. Ej., Fosforotioatos , ARNip ). En cambio, los morfolinos actúan mediante un "bloqueo estérico", uniéndose a una secuencia diana dentro de un ARN, inhibiendo moléculas que de otro modo podrían interactuar con el ARN. [13] Los oligos morfolino se utilizan a menudo para investigar el papel de una transcripción de ARNm específica en un embrión . Los biólogos del desarrollo inyectan oligos de Morfolino en huevos o embriones de pez cebra , [14] rana africana con garras ( Xenopus ), [15] erizo de mar [16] y killifish ( F.heteroclitus ) produciendo embriones de morfantes , o electroporan morfolinos en embriones de pollo [17] en etapas posteriores de desarrollo. Con los sistemas de administración citosólica apropiados, los morfolinos son eficaces en el cultivo celular . [18] [19] Los vivo-morfolinos, en los que el oligo está unido covalentemente a un dendrímero de administración , ingresan a las células cuando se administran sistémicamente en animales adultos o en cultivos de tejidos. [20]
Expresión génica normal en eucariotas
En los organismos eucariotas , el pre-ARNm se transcribe en el núcleo, los intrones se cortan y luego el ARNm maduro se exporta del núcleo al citoplasma . La pequeña subunidad del ribosoma generalmente comienza uniéndose en el extremo 5 'del ARNm y se une allí por varios otros factores de iniciación eucariotas , formando el complejo de iniciación. El complejo de iniciación explora a lo largo de la hebra de ARNm hasta que alcanza un codón de inicio , y luego la subunidad grande del ribosoma se une a la subunidad pequeña y comienza la traducción de una proteína . Todo este proceso se conoce como expresión génica; es el proceso mediante el cual la información de un gen , codificada como una secuencia de bases en el ADN , se convierte en la estructura de una proteína. Un Morfolino puede modificar el empalme, bloquear la traducción o bloquear otros sitios funcionales en el ARN dependiendo de la secuencia de bases del Morfolino.
Bloqueo de traducción
Unido a la región 5 'sin traducir del ARN mensajero (ARNm), los morfolinos pueden interferir con la progresión del complejo de iniciación ribosomal desde el casquete 5' hasta el codón de inicio. Esto evita que la traducción de la región codificante del objetivo transcripción (llamado " derribando " la expresión de genes ). Esto es útil experimentalmente cuando un investigador desea conocer la función de una proteína en particular; Los morfolinos proporcionan un medio conveniente para eliminar la expresión de la proteína y aprender cómo esa eliminación cambia las células o el organismo. Algunos morfolinos derriban la expresión con tanta eficacia que, después de la degradación de proteínas preexistentes, las proteínas objetivo se vuelven indetectables por Western blot .
En 2016, se descubrió que una PMO sintética conjugada con péptidos (PPMO) inhibía la expresión de la metalo-beta-lactamasa de Nueva Delhi , una enzima que muchas bacterias resistentes a los medicamentos utilizan para destruir los carbapenémicos. [21] [22]
Modificación del empalme de pre-ARNm
Los morfolinos pueden interferir con los pasos de procesamiento del pre-mRNA , ya sea evitando que los complejos de ribonucleoproteínas nucleares pequeñas que dirigen el empalme ( snRNP ) se unan a sus objetivos en los bordes de los intrones en una hebra de pre-mRNA, o bloqueando la base de adenina nucleófila y previniéndola de formar la estructura de empalme en lariat, o al interferir con la unión de proteínas reguladoras de empalme, como silenciadores de empalme [23] y potenciadores de empalme . [24] La prevención de la unión de snRNP U1 (en el sitio donante) o U2 / U5 (en la porción de polipirimidina y el sitio aceptor) puede causar empalme modificado , que comúnmente excluye exones del ARNm maduro. Apuntar a algunos objetivos de empalme da como resultado inclusiones de intrones, mientras que la activación de sitios de empalme crípticos puede conducir a inclusiones o exclusiones parciales. [25] Los objetivos de snRNPs U11 / U12 también se pueden bloquear. [26] La modificación del empalme puede ensayarse convenientemente mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa ( RT-PCR ) y se ve como un cambio de banda después de la electroforesis en gel de los productos de RT-PCR. [2]
Otras aplicaciones: bloqueo de otros sitios de ARNm y uso como sondas
Los morfolinos se han utilizado para bloquear la actividad de miARN [27] [28] y la maduración. [29] Los morfolinos marcados con fluoresceína combinados con anticuerpos específicos de fluoresceína se pueden usar como sondas para la hibridación in situ con miARN. [30] Los morfolinos pueden bloquear la actividad de las ribozimas . [31] Las funciones de snRNP de U2 y U12 han sido inhibidas por Morfolinos. [32] Los morfolinos dirigidos a secuencias de ARNm "resbaladizas" dentro de las regiones codificantes de proteínas pueden inducir cambios de marco de traducción . [33] Los morfolinos pueden bloquear la edición de ARN, [34] cola poli-A [35] y secuencias de translocación. [36] Las actividades de los morfolinos contra esta variedad de objetivos sugieren que los morfolinos pueden usarse como una herramienta de propósito general para bloquear interacciones de proteínas o ácidos nucleicos con ARNm.
Efectos de especificidad, estabilidad y no antisentido
Los morfolinos se han convertido en una herramienta de eliminación estándar en los sistemas embrionarios de animales , que tienen un rango de expresión génica más amplio que las células adultas y pueden verse fuertemente afectados por una interacción fuera del objetivo. Después de las inyecciones iniciales en embriones de rana o pez en las etapas unicelular o de pocas células, los efectos morfolino pueden medirse hasta cinco días después, [37] después de que la mayoría de los procesos de organogénesis y diferenciación hayan pasado, con fenotipos observados compatibles con derribo del gen objetivo. Los oligos de control con secuencias irrelevantes no suelen producir cambios en el fenotipo embrionario, evidencia de la especificidad de secuencia del oligo Morfolino y falta de efectos no antisentido. La dosis requerida para una caída se puede reducir mediante la coinyección de varios oligos Morpholino dirigidos al mismo ARNm, que es una estrategia eficaz para reducir o eliminar las interacciones de ARN fuera del objetivo dependientes de la dosis. [38]
Los experimentos de rescate de ARNm a veces pueden restaurar el fenotipo de tipo salvaje en los embriones y proporcionar evidencia de la especificidad de un Morpholino. En un rescate de ARNm, se inyecta conjuntamente un Morpholino con un ARNm que codifica la proteína de la morphlino. Sin embargo, el ARNm de rescate tiene una 5'-UTR (región no traducida) modificada , de modo que el ARNm de rescate no contiene un objetivo para el Morfolino. La región codificante del ARNm de rescate codifica la proteína de interés. La traducción del ARNm de rescate reemplaza la producción de la proteína que fue derribada por Morpholino. Dado que el ARNm de rescate no afectaría los cambios fenotípicos debido a la modulación de la expresión génica fuera del objetivo de Morpholino, este regreso al fenotipo de tipo salvaje es una prueba más de la especificidad de Morpholino. [37] En algunos casos, la expresión ectópica del ARN de rescate hace imposible la recuperación del fenotipo de tipo salvaje.
En embriones, los morfolinos pueden probarse en mutantes nulos para verificar interacciones inesperadas de ARN, luego usarse en un embrión de tipo salvaje para revelar el fenotipo de caída aguda. El fenotipo knockdown es a menudo más extremo que el fenotipo mutante; en el mutante, los efectos de perder el gen nulo pueden ocultarse mediante una compensación genética. [39]
Debido a su columna vertebral completamente antinatural, las proteínas celulares no reconocen a los morfolinos. Las nucleasas no degradan los morfolinos, [40] ni se degradan en el suero o en las células. [41]
Hasta el 18% de los morfolinos parecen inducir fenotipos no relacionados con el objetivo, incluida la muerte celular en el sistema nervioso central y los tejidos somitos de los embriones de pez cebra. [42] La mayoría de estos efectos se deben a la activación de la apoptosis mediada por p53 y pueden suprimirse mediante la co-inyección de un Morpholino anti-p53 junto con el Morpholino experimental. Además, el efecto apoptótico mediado por p53 de una caída de Morfolino se ha fenocopiado usando otro tipo estructural antisentido, mostrando que la apoptosis mediada por p53 es una consecuencia de la pérdida de la proteína diana y no una consecuencia del tipo de oligo de caída. [43] Parece que estos efectos son específicos de la secuencia; como en la mayoría de los casos, si un Morpholino está asociado con efectos no objetivo, el Morpholino de desajuste de 4 bases no desencadenará estos efectos.
Un motivo de preocupación en el uso de morfolinos es el potencial de efectos "fuera del objetivo". Si un fenotipo de morphant observado se debe a la caída prevista o una interacción con un ARN fuera del objetivo, a menudo se puede abordar en embriones ejecutando otro experimento para confirmar que el fenotipo de morphant observado es el resultado de la caída del objetivo esperado. Esto se puede hacer recapitulando el fenotipo morphant con un segundo Morpholino no superpuesto que se dirija al mismo ARNm, [37] mediante la confirmación de los fenotipos observados comparándolos con una cepa mutante (aunque la compensación oscurecerá un fenotipo en algunos mutantes), por probar el Morfolino en un fondo mutante nulo para detectar cambios fenotípicos adicionales o por métodos dominantes-negativos. Como se mencionó anteriormente, el rescate de fenotipos observados mediante la coinyección de un ARNm de rescate es, cuando es factible, una prueba confiable de especificidad de un Morfolino. [37] [39]
Entrega
Para que un morfolino sea eficaz, debe pasar a través de la membrana celular al citosol de una célula. Una vez en el citosol, los morfolinos se difunden libremente entre el citosol y el núcleo, como lo demuestra la actividad de modificación del empalme nuclear de los morfolinos que se observa después de la microinyección en el citosol de las células. Se utilizan diferentes métodos para la administración en embriones, en células cultivadas o en animales adultos. Normalmente se utiliza un aparato de microinyección para la administración en un embrión, y las inyecciones se realizan con mayor frecuencia en la etapa unicelular o de pocas células; [44] un método alternativo para la liberación embrionaria es la electroporación , que puede administrar oligos en tejidos de etapas embrionarias posteriores. [45] Las técnicas comunes para la administración en células cultivadas incluyen el péptido Endo-Porter (que hace que el morfolino se libere de los endosomas ), [19] el sistema de administración especial (que ya no está disponible comercialmente, usó un heterodúplex de ADN de morfolino y un etoxilado reactivo de liberación de polietilenimina ), [18] electroporación, [46] o carga por raspado. [47]
El suministro a los tejidos adultos suele ser difícil, aunque hay algunos sistemas que permiten la captación útil de oligos Morfolino no modificados (incluida la captación en las células musculares con distrofia muscular de Duchenne [48] o las células endoteliales vasculares estresadas durante la angioplastia con balón [49] ). Aunque penetran eficazmente a través de los espacios intercelulares en los tejidos, las PMO no conjugadas tienen una distribución limitada en el citosol y los espacios nucleares dentro de los tejidos sanos después de la administración intravenosa. La administración sistémica en muchas células en organismos adultos se puede lograr mediante el uso de conjugados covalentes de oligos de Morfolino con péptidos que penetran en las células y, aunque la toxicidad se ha asociado con dosis moderadas de los conjugados de péptidos, [50] [51] se han utilizado en vivo para una administración eficaz de oligo en dosis inferiores a las que causan la toxicidad observada. [7] [52] Un dendrímero de octa-guanidinio unido al extremo de un Morpholino puede transportar el oligo modificado (llamado Vivo-Morpholino) de la sangre al citosol. [20] [53] Los morfolinos con capacidad de administración, como los conjugados de péptidos y los vivo-morfolinos, son prometedores como terapéuticos para enfermedades virales y genéticas. [54]
Ver también
- Síntesis de oligonucleótidos
- Análogo de ácido nucleico
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Otras lecturas
- Wiley-Liss, Inc. Número especial: Morpholino Gene Knockdowns of genesis Volumen 30, Número 3, páginas 89-200 (julio de 2001) . Este es un número especial de Genesis que consiste en una serie de artículos breves revisados por pares que utilizan eliminaciones de Morpholino de la función genética en varios sistemas de cultivo de animales y tejidos.
- "Ácidos nucleicos peptídicos, morfolinos y biomoléculas antisentido relacionadas". eds. Janson y durante (Springer, 2007)
- Moulton J (2007). "Uso de morfolinos para controlar la expresión genética (Unidad 4.30)". En Beaucage S (ed.). Protocolos actuales en química de ácidos nucleicos . Nueva Jersey: John Wiley & Sons, Inc. ISBN 978-0-471-24662-6.