La síntesis de genes artificiales , o síntesis de genes , se refiere a un grupo de métodos que se utilizan en biología sintética para construir y ensamblar genes a partir de nucleótidos de novo . A diferencia de la síntesis de ADN en células vivas, la síntesis de genes artificiales no requiere ADN molde, lo que permite sintetizar prácticamente cualquier secuencia de ADN en el laboratorio. Consta de dos pasos principales, el primero de los cuales es la síntesis de ADN en fase sólida , a veces conocida como impresión de ADN . [1]Esto produce fragmentos de oligonucleótidos que generalmente tienen menos de 200 pares de bases. El segundo paso implica conectar estos fragmentos de oligonucleótidos utilizando varios métodos de ensamblaje de ADN. Debido a que la síntesis de genes artificiales no requiere ADN molde, teóricamente es posible hacer una molécula de ADN completamente sintética sin límites en la secuencia o tamaño de nucleótidos.
La síntesis del primer gen completo, un ARNt de levadura , fue demostrada por Har Gobind Khorana y colaboradores en 1972. [2] La síntesis de los primeros genes codificadores de péptidos y proteínas se realizó en los laboratorios de Herbert Boyer y Alexander Markham , respectivamente. [3] [4] Más recientemente, se han desarrollado métodos de síntesis de genes artificiales que permitirán el ensamblaje de cromosomas y genomas completos. El primer cromosoma de levadura sintético se sintetizó en 2014 y también se sintetizaron cromosomas bacterianos funcionales completos . [5] Además, la síntesis de genes artificiales podría hacer uso en el futuro de nuevos pares de nucleobase (pares de bases no naturales). [6] [7] [8]
Métodos estándar para la síntesis de ADN
Síntesis de oligonucleótidos
Los oligonucleótidos se sintetizan químicamente utilizando componentes básicos llamados fosforamiditas de nucleósidos . Estos pueden ser nucleósidos normales o modificados que tienen grupos protectores para evitar que sus aminas, grupos hidroxilo y grupos fosfato interactúen incorrectamente. Se agrega una fosforamidita a la vez, se desprotege el grupo hidroxilo 5 'y se agrega una nueva base y así sucesivamente. La cadena crece en la dirección de 3 'a 5', que es hacia atrás en relación con la biosíntesis. Al final, se eliminan todos los grupos protectores. Sin embargo, al tratarse de un proceso químico, se producen varias interacciones incorrectas que dan lugar a algunos productos defectuosos. Cuanto más larga sea la secuencia de oligonucleótidos que se está sintetizando, más defectos habrá, por lo que este proceso solo es práctico para producir secuencias cortas de nucleótidos . El límite práctico actual es de aproximadamente 200 pb ( pares de bases ) para un oligonucleótido con calidad suficiente para usarse directamente para una aplicación biológica. Se puede utilizar HPLC para aislar productos con la secuencia adecuada. Mientras tanto, se puede sintetizar una gran cantidad de oligos en paralelo en chips genéticos . Para un rendimiento óptimo en los procedimientos posteriores de síntesis de genes, deben prepararse individualmente y en escalas más grandes.
Conexión de oligonucleótidos basada en recocido
Por lo general, se elabora un conjunto de oligonucleótidos diseñados individualmente en sintetizadores automáticos de fase sólida, se purifica y luego se conecta mediante reacciones específicas de hibridación y ligación estándar o polimerasa . Para mejorar la especificidad de la hibridación de oligonucleótidos, el paso de síntesis se basa en un conjunto de enzimas polimerasas y ligasa de ADN termoestables . Hasta la fecha, se han descrito varios métodos para la síntesis de genes, como la ligación de oligonucleótidos superpuestos fosforilados, [2] [3] el método Fok I [4] y una forma modificada de reacción en cadena de ligasa para la síntesis de genes. Además, se han descrito varios enfoques de ensamblaje de PCR . [9] Por lo general, emplean oligonucleótidos de 40 a 50 nucleótidos de largo que se superponen entre sí. Estos oligonucleótidos están diseñados para cubrir la mayor parte de la secuencia de ambas cadenas, y la molécula de longitud completa se genera progresivamente mediante PCR de extensión por superposición (OE), [9] PCR de adentro hacia afuera (TBIO) equilibrada termodinámicamente [10] o enfoques combinados. [11] Los genes sintetizados con mayor frecuencia varían en tamaño de 600 a 1200 pb, aunque se han creado genes mucho más largos conectando fragmentos previamente ensamblados de menos de 1000 pb. En este intervalo de tamaños, es necesario probar varios clones candidatos que confirmen la secuencia del gen sintético clonado mediante métodos de secuenciación automatizados.
Limitaciones
Además, debido a que el ensamblaje del producto génico de longitud completa se basa en la alineación eficiente y específica de oligonucleótidos monocatenarios largos, los parámetros críticos para el éxito de la síntesis incluyen regiones de secuencia extendida que comprenden estructuras secundarias causadas por repeticiones invertidas, contenido de GC extraordinariamente alto o bajo, o estructuras repetitivas. Por lo general, estos segmentos de un gen en particular solo se pueden sintetizar dividiendo el procedimiento en varios pasos consecutivos y un ensamblaje final de subsecuencias más cortas, lo que a su vez conduce a un aumento significativo en el tiempo y la mano de obra necesarios para su producción. El resultado de un experimento de síntesis de genes depende en gran medida de la calidad de los oligonucleótidos utilizados. Para estos protocolos de síntesis de genes basados en hibridación, la calidad del producto depende directa y exponencialmente de la exactitud de los oligonucleótidos empleados. Alternativamente, después de realizar la síntesis de genes con oligos de menor calidad, se debe hacer un mayor esfuerzo en la garantía de calidad aguas abajo durante el análisis de clones, que generalmente se realiza mediante procedimientos de secuenciación y clonación estándar que consumen mucho tiempo. Otro problema asociado con todos los métodos de síntesis de genes actuales es la alta frecuencia de errores de secuencia debido al uso de oligonucleótidos sintetizados químicamente. La frecuencia de error aumenta con oligonucleótidos más largos y, como consecuencia, el porcentaje de producto correcto disminuye drásticamente a medida que se usan más oligonucleótidos. El problema de la mutación podría resolverse mediante oligonucleótidos más cortos utilizados para ensamblar el gen. Sin embargo, todos los métodos de ensamblaje basados en recocido requieren que las imprimaciones se mezclen en un solo tubo. En este caso, los solapamientos más cortos no siempre permiten el apareamiento preciso y específico de los cebadores complementarios, lo que da como resultado la inhibición de la formación de productos de longitud completa. El diseño manual de oligonucleótidos es un procedimiento laborioso y no garantiza la síntesis exitosa del gen deseado. Para un rendimiento óptimo de casi todos los métodos basados en hibridación, se supone que las temperaturas de fusión de las regiones superpuestas son similares para todos los oligonucleótidos. La optimización de cebadores necesaria debe realizarse utilizando programas de diseño de oligonucleótidos especializados. Hasta ahora se han presentado varias soluciones para el diseño automatizado de cebadores para la síntesis de genes. [12] [13] [14]
Procedimientos de corrección de errores
Para superar los problemas asociados con la calidad de los oligonucleótidos, se han desarrollado varias estrategias elaboradas, empleando oligonucleótidos de pesca preparados por separado, [15] enzimas de unión a errores de apareamiento de la familia mutS [16] o endonucleasas específicas de bacterias o fagos. [17] No obstante, todas estas estrategias aumentan el tiempo y los costes de la síntesis de genes basada en el apareamiento de oligonucleótidos sintetizados químicamente.
La secuenciación masivamente paralela también se ha utilizado como una herramienta para seleccionar bibliotecas de oligonucleótidos complejas y permitir la recuperación de moléculas precisas. En un enfoque, los oligonucleótidos se secuencian en la plataforma de pirosecuenciación 454 y un sistema robótico crea imágenes y selecciona perlas individuales correspondientes a la secuencia precisa. [18] En otro enfoque, una biblioteca de oligonucleótidos compleja se modifica con etiquetas flanqueantes únicas antes de la secuenciación masivamente paralela. A continuación, los cebadores dirigidos por etiquetas permiten la recuperación de moléculas con las secuencias deseadas mediante PCR de marcación. [19]
Cada vez más, los genes se ordenan en conjuntos que incluyen genes relacionados funcionalmente o variantes de secuencia múltiple en un solo gen. Prácticamente todas las proteínas terapéuticas en desarrollo, como los anticuerpos monoclonales, se optimizan probando muchas variantes de genes para mejorar su función o expresión.
Pares de bases antinaturales
Si bien la síntesis tradicional de ácidos nucleicos solo usa 4 pares de bases: adenina, timina, guanina y citosina, la síntesis de oligonucleótidos en el futuro podría incorporar el uso de pares de bases no naturales, que son bases nucleicas diseñadas y sintetizadas artificialmente que no se encuentran en la naturaleza.
En 2012, un grupo de científicos estadounidenses dirigido por Floyd Romesberg, biólogo químico del Instituto de Investigación Scripps en San Diego, California, publicó que su equipo diseñó un par de bases no naturales (UBP). Los dos nuevos nucleótidos artificiales o pares de bases no naturales (UBP) se denominaron d5SICS y dNaM . Más técnicamente, estos nucleótidos artificiales que llevan nucleobases hidrófobas , presentan dos anillos aromáticos fusionados que forman un complejo (d5SICS – dNaM) o un par de bases en el ADN. En 2014, el mismo equipo del Instituto de Investigación Scripps informó que sintetizaron un tramo de ADN circular conocido como un plásmido que contiene pares de bases TA y CG naturales junto con el laboratorio de UBP Romesberg de mejor rendimiento que había diseñado, y lo insertaron en células de los comunes. bacteria E. coli que reprodujo con éxito los pares de bases no naturales a través de múltiples generaciones. Este es el primer ejemplo conocido de un organismo vivo que transmite un código genético ampliado a las generaciones posteriores. Esto se logró en parte mediante la adición de un gen de algas de apoyo que expresa un transportador de trifosfato de nucleótidos que importa eficientemente los trifosfatos de d5SICSTP y dNaMTP a la bacteria E. coli . Luego, las vías de replicación bacteriana natural las utilizan para replicar con precisión el plásmido que contiene d5SICS – dNaM.
La incorporación exitosa de un tercer par de bases es un avance significativo hacia el objetivo de expandir en gran medida el número de aminoácidos que pueden ser codificados por el ADN, de los 20 aminoácidos existentes a 172 teóricamente posibles, expandiendo así el potencial de los organismos vivos para producir nuevas proteínas . [20] En el futuro, estos pares de bases no naturales podrían sintetizarse e incorporarse en oligonucleótidos mediante métodos de impresión de ADN.
Ensamblaje de ADN
Por tanto, la impresión de ADN se puede utilizar para producir partes de ADN, que se definen como secuencias de ADN que codifican una función biológica específica (por ejemplo, promotores , secuencias reguladoras de la transcripción o marcos de lectura abiertos ). [21] Sin embargo, debido a que la síntesis de oligonucleótidos generalmente no puede producir con precisión secuencias de oligonucleótidos de más de unos pocos cientos de pares de bases, se deben emplear métodos de ensamblaje de ADN para ensamblar estas partes para crear genes funcionales, circuitos multigénicos o incluso cromosomas o genomas sintéticos completos. . Algunas técnicas de ensamblaje de ADN solo definen protocolos para unir partes de ADN, mientras que otras técnicas también definen las reglas para el formato de las partes de ADN que son compatibles con ellas. Estos procesos se pueden ampliar para permitir el ensamblaje de cromosomas o genomas completos. En los últimos años, ha habido una proliferación en el número de diferentes estándares de ensamblaje de ADN con 14 estándares de ensamblaje diferentes desarrollados a partir de 2015, cada uno con sus pros y sus contras. [22] En general, el desarrollo de estándares de ensamblaje de ADN ha facilitado enormemente el flujo de trabajo de la biología sintética, ha ayudado al intercambio de material entre grupos de investigación y también ha permitido la creación de partes de ADN modulares y reutilizables. [22]
Los diversos métodos de ensamblaje de ADN se pueden clasificar en tres categorías principales: ensamblaje mediado por endonucleasas, recombinación específica de sitio y ensamblaje basado en superposición larga. [22] Cada grupo de métodos tiene sus características distintas y sus propias ventajas y limitaciones.
Ensamblaje mediado por endonucleasas
Las endonucleasas son enzimas que reconocen y escinden segmentos de ácido nucleico y pueden usarse para dirigir el ensamblaje del ADN. De los diferentes tipos de enzimas de restricción, las enzimas de restricción de tipo II son las más comúnmente disponibles y utilizadas porque sus sitios de escisión están ubicados cerca o en sus sitios de reconocimiento. Por lo tanto, los métodos de ensamblaje mediados por endonucleasas hacen uso de esta propiedad para definir partes de ADN y protocolos de ensamblaje.
BioLadrillos
El estándar de ensamblaje BioBricks fue descrito e introducido por Tom Knight en 2003 y se ha actualizado constantemente desde entonces. [23] Actualmente, el estándar de BioBricks más utilizado es el estándar de ensamblaje 10 o BBF RFC 10. BioBricks define las secuencias de prefijos y sufijos necesarios para que una parte de ADN sea compatible con el método de ensamblaje de BioBricks, lo que permite la unión de todo el ADN. partes que están en formato BioBricks.
El prefijo contiene los sitios de restricción para EcoRI, NotI y XBaI, mientras que el sufijo contiene los sitios de restricción SpeI, NotI y PstI. Fuera de las regiones de prefijo y sufijo, la parte de ADN no debe contener estos sitios de restricción. Para unir dos partes de BioBrick, uno de los plásmidos se digiere con EcoRI y SpeI mientras que el segundo plásmido se digiere con EcoRI y XbaI. Los dos salientes EcoRI son complementarios y, por tanto, se templarán juntos, mientras que SpeI y XbaI también producen salientes complementarios que también se pueden ligar entre sí. Como el plásmido resultante contiene las secuencias de prefijos y sufijos originales, se puede usar para unir más partes de BioBricks. [24] Debido a esta propiedad, se dice que el estándar de ensamblaje BioBricks es de naturaleza idempotente . Sin embargo, también habrá una secuencia de "cicatriz" (ya sea TACTAG o TACTAGAG) formada entre los dos BioBricks fusionados. Esto evita que los BioBricks se utilicen para crear proteínas de fusión, ya que la secuencia de cicatriz de 6 pb codifica una tirosina y un codón de parada, lo que hace que la traducción finalice después de que se exprese el primer dominio, mientras que la secuencia de cicatriz de 8 pb provoca un cambio de marco , lo que evita la lectura continua de los codones. Para ofrecer secuencias de cicatrices alternativas que, por ejemplo, dan una cicatriz de 6 pb, o secuencias de cicatrices que no contienen codones de parada, se diseñaron otros estándares de ensamblaje como BB-2 Assembly, BglBricks Assembly, Silver Assembly y Freiburg Assembly. [25] [26] [27] [28]
Si bien el método más fácil para ensamblar piezas de BioBrick se describe anteriormente, también existen varios otros métodos de ensamblaje de uso común que ofrecen varias ventajas sobre el ensamblaje estándar. El ensamblaje de 3 antibióticos (3A) permite seleccionar el ensamblaje correcto mediante la selección de antibióticos, mientras que el ensamblaje de inserto amplificado busca superar la baja eficiencia de transformación observada en el ensamblaje 3A. [29] [30]
El estándar de ensamblaje de BioBrick también ha servido de inspiración para el uso de otros tipos de endonucleasas para el ensamblaje de ADN. Por ejemplo, tanto el estándar iBrick como los estándares de ensamblaje del vector HomeRun emplean endonucleasas autodirigidas en lugar de enzimas de restricción de tipo II. [31] [32]
Ensamblaje de endonucleasas de restricción de tipo II
Algunos métodos de ensamblaje también utilizan endonucleasas de restricción de tipo II. Estos difieren de otras endonucleasas de tipo II en que cortan varios pares de bases del sitio de reconocimiento. Como resultado, la secuencia de voladizo se puede modificar para que contenga la secuencia deseada. Esto proporciona a los métodos de ensamblaje del Tipo II dos ventajas: permite el ensamblaje "sin cicatrices" y permite el ensamblaje de varias piezas en una sola olla. Los métodos de ensamblaje que utilizan endonucleasas de tipo II incluyen Golden Gate y sus variantes asociadas.
Clonación de Golden Gate
El protocolo de ensamblaje de Golden Gate fue definido por Engler et al. 2008 para definir un método de ensamblaje de ADN que daría una construcción final sin una secuencia de cicatriz, mientras que también carece de los sitios de restricción originales. Esto permite que la proteína se exprese sin contener secuencias de proteínas no deseadas que podrían afectar negativamente al plegamiento o expresión de proteínas. Al usar la enzima de restricción BsaI que produce un saliente de 4 pares de bases, se pueden usar hasta 240 secuencias no palindrómicas únicas para el ensamblaje. [33]
Diseño y montaje de plásmidos
En la clonación Golden Gate, cada fragmento de ADN que se va a ensamblar se coloca en un plásmido, flanqueado por sitios de restricción BsaI orientados hacia adentro que contienen las secuencias salientes programadas. Para cada fragmento de ADN, la secuencia saliente 3 'es complementaria a la saliente 5' del siguiente fragmento de ADN corriente abajo. Para el primer fragmento, el saliente 5 'es complementario al saliente 5' del plásmido de destino, mientras que el saliente 3 'del fragmento final es complementario al saliente 3' del plásmido de destino. Tal diseño permite que todos los fragmentos de ADN se ensamblen en una reacción en un solo recipiente (donde todos los reactivos se mezclan), con todos los fragmentos dispuestos en la secuencia correcta. Las construcciones ensambladas con éxito se seleccionan detectando la pérdida de función de un casete de exploración que estaba originalmente en el plásmido de destino. [33]
MoClo y trenza dorada
El ensamblaje Golden Gate original solo permite que se haga una única construcción en el vector de destino. Para permitir que esta construcción se use en una reacción posterior como vector de entrada, se diseñaron los estándares MoClo y Golden Braid. [34]
El estándar MoClo implica definir múltiples niveles de ensamblaje de ADN:
- Nivel 1: El ensamblaje de Nivel 1 es el ensamblaje estándar de Golden Gate, y los genes se ensamblan a partir de sus partes componentes (partes de ADN que codifican elementos genéticos como UTR , promotores, sitios de unión de ribosomas o secuencias terminadoras ). Flanqueando el sitio de inserción de los vectores de destino de nivel 1 hay un par de sitios de restricción BpiI de corte hacia adentro. Esto permite que estos plásmidos se utilicen como vectores de entrada para los vectores de destino de nivel dos.
- Nivel 2: El ensamblaje del Nivel 2 implica el ensamblaje adicional de los genes ensamblados en el ensamblaje del Nivel 1 en construcciones de múltiples genes. Si existe la necesidad de un ensamblaje de nivel superior adicional, se pueden agregar sitios de restricción BsaI de corte hacia adentro para flanquear los sitios de inserción. Estos vectores pueden usarse luego como vectores de entrada para construcciones de nivel superior.
Cada nivel de ensamblaje alterna el uso de sitios de restricción BsaI y BpiI para minimizar el número de sitios prohibidos, y el ensamblaje secuencial para cada nivel se logra siguiendo el diseño del plásmido Golden Gate. En general, el estándar MoClo permite el ensamblaje de una construcción que contiene múltiples unidades de transcripción, todas ensambladas a partir de diferentes partes de ADN, mediante una serie de reacciones Golden Gate en un solo recipiente. Sin embargo, un inconveniente del estándar MoClo es que requiere el uso de 'partes falsas' sin función biológica, si la construcción final requiere menos de cuatro partes componentes. [35] El estándar Golden Braid, por otro lado, introdujo un estándar de ensamblaje Golden Gate por pares.
El estándar Golden Braid utiliza el mismo ensamblaje por niveles que MoClo, pero cada nivel solo implica el ensamblaje de dos fragmentos de ADN, es decir, un enfoque por pares. Por tanto, en cada nivel, los pares de genes se clonan en un fragmento de destino en la secuencia deseada, y estos se ensamblan posteriormente de dos en dos en niveles sucesivos. Al igual que MoClo, el estándar Golden Braid alterna las enzimas de restricción BsaI y BpiI entre cada nivel.
El desarrollo de los métodos de ensamblaje de Golden Gate y sus variantes ha permitido a los investigadores diseñar kits de herramientas para acelerar el flujo de trabajo de biología sintética. Por ejemplo, EcoFlex se desarrolló como un conjunto de herramientas para E. Coli que utiliza el estándar MoClo para sus partes de ADN, mientras que también se ha desarrollado un conjunto de herramientas similar para diseñar el mircoalgae Chlamydomonas reinhardtii . [36] [37]
Recombinación específica del sitio
La recombinación de sitio específico hace uso de fagos integrasas en lugar de enzimas de restricción, eliminando la necesidad de tener sitios de restricción en los fragmentos de ADN. En cambio, las integrasas hacen uso de sitios de unión únicos (att) y catalizan el reordenamiento del ADN entre el fragmento objetivo y el vector de destino. El sistema de clonación Invitrogen Gateway se inventó a finales de la década de 1990 y utiliza dos mezclas de enzimas patentadas, la clonasa BP y la clonasa LR. La mezcla de clonasa BP cataliza la recombinación entre los sitios attB y attP, generando sitios attL y attR híbridos, mientras que la mezcla clonasa LR cataliza la recombinación de los sitios attL y attR para dar sitios attB y attP. Como cada mezcla de enzimas reconoce solo sitios att específicos, la recombinación es muy específica y los fragmentos se pueden ensamblar en la secuencia deseada. [38]
Diseño y montaje de vectores
Debido a que la clonación de Gateway es una tecnología patentada, todas las reacciones de Gateway deben llevarse a cabo con el kit de Gateway proporcionado por el fabricante. La reacción se puede resumir en dos pasos. El primer paso consiste en ensamblar los clones de entrada que contienen el fragmento de ADN de interés, mientras que el segundo paso consiste en insertar este fragmento de interés en el clon de destino.
- Los clones de entrada deben realizarse utilizando los vectores "Donantes" suministrados que contienen un casete Gateway flanqueado por sitios attP. El casete Gateway contiene un gen suicida bacteriano (por ejemplo, ccdB ) que permitirá la supervivencia y la selección de clones de entrada recombinados con éxito. Se agregan un par de sitios attB para flanquear el fragmento de ADN de interés, y esto permitirá la recombinación con los sitios attP cuando se agregue la mezcla de clonasa BP. Se producen clones de entrada y el fragmento de interés está flanqueado por sitios attL.
- El vector de destino también viene con un casete Gateway, pero está flanqueado por un par de sitios attR. La mezcla de este plásmido de destino con los clones de entrada y la mezcla de clonasa LR permitirá que se produzca la recombinación entre los sitios attR y attL. Se produce un clon de destino, con el fragmento de interés insertado con éxito. El gen letal se inserta en el vector original y las bacterias transformadas con este plásmido morirán. Por tanto, el vector deseado se puede seleccionar fácilmente.
Las primeras iteraciones del método de clonación de Gateway solo permitieron que se usara un solo clon de entrada para cada clon de destino producido. Sin embargo, investigaciones posteriores revelaron que se podrían generar cuatro secuencias att ortogonales más, lo que permitiría el ensamblaje de hasta cuatro fragmentos de ADN diferentes, y este proceso ahora se conoce como tecnología Multisite Gateway. [39]
Además de la clonación de Gateway, también se han desarrollado métodos no comerciales que utilizan otras integrasas. Por ejemplo, el método de ensamblaje recombinacional de serina integrasa (SIRA) usa la integrasa ϕC31, mientras que el método de ensamblaje en tándem basado en recombinación específica del sitio (SSRTA) usa la integrasa φBT1 del fago de Streptomyces . [40] [41] Otros métodos, como el HomeRun Vector Assembly System (HVAS), se basan en el sistema de clonación Gateway e incorporan endoucleases homing para diseñar un protocolo que podría apoyar la síntesis industrial de construcciones de ADN sintético. [31]
Ensamblaje basado en superposición larga
Ha habido una variedad de métodos de ensamblaje basados en superposición larga desarrollados en los últimos años. Uno de los métodos más utilizados, el método de ensamblaje de Gibson, se desarrolló en 2009 y proporciona un método de ensamblaje de ADN en un solo recipiente que no requiere el uso de enzimas de restricción o integrasas. [42] Otros métodos de ensamblaje similares basados en superposición incluyen la clonación de extensión de polimerasa circular (CPEC), la clonación independiente de secuencia y ligasa (SLIC) y el extracto de clonación de ligadura sin costuras (SLiCE). [43] [44] [45] A pesar de la presencia de muchos métodos de ensamblaje superpuestos, el método de ensamblaje de Gibson sigue siendo el más popular. [46] Además de los métodos enumerados anteriormente, otros investigadores se han basado en los conceptos utilizados en el ensamblaje de Gibson y otros métodos de ensamblaje para desarrollar nuevas estrategias de ensamblaje como la estrategia Modular Overlap-Directed Assembly with Linkers (MODAL), o el estándar de ensamblaje Biopart para Idempotent Método de clonación (BÁSICO). [47] [48]
Montaje de Gibson
El método de ensamblaje de Gibson es un método de ensamblaje de ADN relativamente sencillo, que requiere solo unos pocos reactivos adicionales: la exonucleasa 5 'T5 , la ADN polimerasa de Phusion y la ADN ligasa Taq . Los fragmentos de ADN que se van a ensamblar se sintetizan para tener extremos 5 'y 3' superpuestos en el orden en el que deben ensamblarse. Estos reactivos se mezclan con los fragmentos de ADN que se ensamblan a 50 ° C y se producen las siguientes reacciones:
- La exonucleasa T5 mastica el ADN del extremo 5 'de cada fragmento, exponiendo los salientes 3' de cada fragmento de ADN.
- Los salientes complementarios de los fragmentos de ADN adyacentes se aparean mediante el apareamiento de bases complementarias.
- La ADN polimerasa de Phusion rellena cualquier espacio donde se hibridan los fragmentos.
- La ligasa de ADN Taq repara las mellas en ambas cadenas de ADN.
Debido a que la exonucleasa T5 es termolábil, se inactiva a 50 ° C después del paso inicial de masticación. Por tanto, el producto es estable y los fragmentos se ensamblan en el orden deseado. Este protocolo de un solo recipiente puede ensamblar hasta 5 fragmentos diferentes con precisión, mientras que varios proveedores comerciales tienen kits para ensamblar con precisión hasta 15 fragmentos diferentes en una reacción de dos pasos. [49] Sin embargo, aunque el protocolo de ensamblaje de Gibson es rápido y utiliza relativamente pocos reactivos, requiere una síntesis de ADN a medida, ya que cada fragmento debe diseñarse para contener secuencias superpuestas con los fragmentos adyacentes y amplificarse mediante PCR. Esta dependencia de la PCR también puede afectar la fidelidad de la reacción cuando se utilizan fragmentos largos, fragmentos con alto contenido de GC o secuencias repetidas. [48]
MODAL
La estrategia MODAL define secuencias superpuestas conocidas como "enlazadores" para reducir la cantidad de personalización que debe realizarse con cada fragmento de ADN. Los enlazadores se diseñaron utilizando el software R2oDNA Designer y las regiones de superposición se diseñaron para tener una longitud de 45 pb para ser compatibles con el ensamblaje de Gibson y otros métodos de ensamblaje de solapamiento. Para unir estos enlazadores a las partes que se van a ensamblar, la PCR se lleva a cabo utilizando cebadores específicos de la parte que contienen secuencias adaptadoras de prefijo y sufijo de 15 pb. A continuación, los enlazadores se unen a las secuencias del adaptador mediante una segunda reacción de PCR. Para colocar los fragmentos de ADN, el mismo enlazador se unirá al sufijo del fragmento cadena arriba deseado y al prefijo de los fragmentos cadena abajo deseados. Una vez que se unen los enlazadores, se pueden usar el ensamblaje de Gibson, CPEC u otros métodos de ensamblaje de superposición para ensamblar los fragmentos de ADN en el orden deseado.
BÁSICO
La estrategia de ensamblaje BÁSICA se desarrolló en 2015 y buscaba abordar las limitaciones de las técnicas de ensamblaje anteriores, incorporando seis conceptos clave de ellas: piezas estándar reutilizables; formato de un solo nivel (todas las piezas tienen el mismo formato y se ensamblan mediante el mismo proceso); clonación idempotente; ensamblaje de ADN paralelo (multiparte); independencia de tamaño; automatizabilidad. [48]
Diseño de conectores y partes de ADN
Las partes de ADN se diseñan y clonan en plásmidos de almacenamiento, con la parte flanqueada por un prefijo integrado ( i P) y una secuencia de sufijo integrado ( i S). Las secuencias i P e i S contienen sitios de restricción BsaI orientados hacia adentro, que contienen salientes complementarios a los enlazadores BASIC. [48] Al igual que en MODAL, los 7 enlazadores estándar utilizados en BASIC se diseñaron con el software R2oDNA Designer y se analizaron para garantizar que no contienen secuencias con homología con los genomas del chasis y que no contienen secuencias no deseadas como secuencias de estructura secundaria. , sitios de restricción o sitios de unión ribosómica. Cada secuencia enlazadora se divide en dos mitades, cada una con un saliente de 4 pb complementario al sitio de restricción BsaI, una secuencia bicatenaria de 12 pb y que comparte una secuencia de superposición de 21 pb con la otra mitad. La mitad que se unirá a la parte de ADN corriente arriba se conoce como la parte del enlazador de sufijo (por ejemplo, L1S) y la mitad que se une a la parte corriente abajo se conoce como la parte del enlazador de prefijo (por ejemplo, L1P). Estos enlazadores forman la base del ensamblaje de las partes del ADN.
Además de dirigir el orden de montaje, los enlazadores BASIC estándar también se pueden modificar para realizar otras funciones. Para permitir el ensamblaje idempotente, los enlazadores también se diseñaron con secuencias de i P e i S metiladas adicionales insertadas para protegerlos de ser reconocidos por BsaI. Esta metilación se pierde después de la transformación y la replicación del plásmido in vivo, y los plásmidos pueden extraerse, purificarse y usarse para reacciones posteriores.
Debido a que la secuencia del enlazador es relativamente larga (45 pb para un enlazador estándar), existe la oportunidad de incorporar secuencias de ADN funcionales para reducir el número de partes de ADN necesarias durante el ensamblaje. El estándar de ensamblaje BÁSICO proporciona varios enlazadores integrados con RBS de diferentes fortalezas. De manera similar, para facilitar la construcción de proteínas de fusión que contienen múltiples dominios de proteínas, también se diseñaron varios enlazadores de fusión para permitir la lectura completa de la construcción de ADN. Estos enlazadores de fusión codifican un polipéptido de glicina y serina de 15 aminoácidos, que es un péptido enlazador ideal para proteínas de fusión con múltiples dominios.
Montaje
Hay tres pasos principales en el ensamblaje de la construcción final.
- Primero, las partes de ADN se escinden del plásmido de almacenamiento, dando un fragmento de ADN con proyecciones de BsaI en el extremo 3 'y 5'.
- A continuación, cada parte enlazadora se une a su respectiva parte de ADN incubando con T4 ADN ligasa. Cada parte de ADN tendrá un sufijo y una parte de enlazador de prefijo de dos enlazadores diferentes para dirigir el orden de ensamblaje. Por ejemplo, la primera parte de la secuencia tendrá L1P y L2S, mientras que la segunda parte tendrá L2P y L3S adjuntas. Las piezas del enlazador se pueden cambiar para cambiar la secuencia de montaje.
- Finalmente, las partes con los conectores adjuntos se ensamblan en un plásmido incubando a 50 ° C. Los salientes de 21 pb de los enlazadores P y S se aparean y la construcción final se puede transformar en células bacterianas para la clonación. Las mellas de una sola hebra se reparan in vivo después de la transformación, produciendo una construcción final estable clonada en plásmidos.
Aplicaciones
Dado que los métodos de impresión y ensamblaje de ADN han permitido que la síntesis de genes comerciales se vuelva progresiva y exponencialmente más barata en los últimos años, [50] la síntesis de genes artificiales representa una herramienta de ingeniería poderosa y flexible para crear y diseñar nuevas secuencias de ADN y funciones de proteínas. Además de la biología sintética, varias áreas de investigación, como las que involucran la expresión de genes heterólogos , el desarrollo de vacunas , la terapia génica y la ingeniería molecular, se beneficiarían enormemente de tener métodos rápidos y baratos para sintetizar ADN para codificar proteínas y péptidos. [51] Los métodos utilizados para la impresión y el ensamblaje de ADN incluso han permitido el uso de ADN como medio de almacenamiento de información .
Sintetizar genomas bacterianos
Laboratorio de Synthia y Mycoplasma
El 28 de junio de 2007, un equipo del Instituto J. Craig Venter publicó un artículo en Science Express , diciendo que habían trasplantado con éxito el ADN natural de una bacteria Mycoplasma mycoides a una célula Mycoplasma capricolum , creando una bacteria que se comportaba como una M .mycoides . [52]
El 6 de octubre de 2007, Craig Venter anunció en una entrevista con el periódico The Guardian del Reino Unido que el mismo equipo había sintetizado una versión modificada del cromosoma único de Mycoplasma genitalium de forma artificial. El cromosoma se modificó para eliminar todos los genes que las pruebas en bacterias vivas habían demostrado ser innecesarias. El siguiente paso planificado en este proyecto de genoma mínimo es trasplantar el genoma mínimo sintetizado a una célula bacteriana con su antiguo ADN eliminado; la bacteria resultante se llamará Mycoplasma laboratorium . Al día siguiente, el grupo de bioética canadiense , ETC Group, emitió un comunicado a través de su representante, Pat Mooney , diciendo que la "creación" de Venter era "un chasis en el que se podía construir casi cualquier cosa". El genoma sintetizado aún no se había trasplantado a una célula funcional. [53]
El 21 de mayo de 2010, Science informó que el grupo Venter había sintetizado con éxito el genoma de la bacteria Mycoplasma mycoides a partir de un registro informático y trasplantado el genoma sintetizado a la célula existente de una bacteria Mycoplasma capricolum a la que se le había extraído el ADN. La bacteria "sintética" era viable, es decir, capaz de replicarse miles de millones de veces. El equipo había planeado originalmente usar la bacteria M. genitalium con la que habían estado trabajando anteriormente, pero cambió a M. mycoides porque esta última bacteria crece mucho más rápido, lo que se tradujo en experimentos más rápidos. [54] Venter lo describe como "la primera especie ... en que sus padres sean una computadora". [55] La bacteria transformada recibe el nombre de " Synthia " por ETC. Un portavoz de Venter se ha negado a confirmar cualquier avance en el momento de escribir este artículo.
Levadura sintética 2.0
Como parte del proyecto Synthetic Yeast 2.0, varios grupos de investigación de todo el mundo han participado en un proyecto para sintetizar genomas de levadura sintética y, mediante este proceso, optimizar el genoma del organismo modelo Saccharomyces cerevisae . [56] El proyecto Yeast 2.0 aplicó varios métodos de ensamblaje de ADN que se han discutido anteriormente, y en marzo de 2014, Jef Boeke del Centro Médico Langone de la Universidad de Nueva York, reveló que su equipo había sintetizado el cromosoma III de S. cerevisae . [57] [58] El procedimiento implicó reemplazar los genes en el cromosoma original con versiones sintéticas y luego el cromosoma sintético terminado se integró en una célula de levadura. Se requirió diseñar y crear 273,871 pares de bases de ADN, menos que los 316,667 pares del cromosoma original. En marzo de 2017, se completó la síntesis de 6 de los 16 cromosomas, y la síntesis de los demás aún está en curso. [59]
Ver también
- secuencia ADN
- Modificación genética
- Ingeniería de proteínas
- Base de datos de genes sintéticos
Notas
- ^ Stein R (7 de mayo de 2015). "La impresión de ADN es una gran ayuda para la investigación, pero algunos plantean preocupaciones" . Todas las cosas consideradas . Radio Pública Nacional.
- ^ a b Khorana HG, Agarwal KL, Büchi H, Caruthers MH, Gupta NK, Kleppe K, et al. (Diciembre de 1972). "Estudios sobre polinucleótidos. 103. Síntesis total del gen estructural para un ácido ribonucleico de transferencia de alanina de levadura". Revista de Biología Molecular . 72 (2): 209-17. doi : 10.1016 / 0022-2836 (72) 90146-5 . PMID 4571075 .
- ^ a b Itakura K, Hirose T, Crea R, Riggs AD, Heyneker HL, Bolivar F, Boyer HW (diciembre de 1977). "Expresión en Escherichia coli de un gen sintetizado químicamente para la hormona somatostatina". Ciencia . 198 (4321): 1056–63. Código Bibliográfico : 1977Sci ... 198.1056I . doi : 10.1126 / science.412251 . PMID 412251 .
- ^ a b Edge MD, Green AR, Heathcliffe GR, Meacock PA, Schuch W, Scanlon DB, et al. (Agosto de 1981). "Síntesis total de un gen de interferón leucocitario humano". Naturaleza . 292 (5825): 756–62. Código Bibliográfico : 1981Natur.292..756E . doi : 10.1038 / 292756a0 . PMID 6167861 . S2CID 4330168 .
- ^ Shukman D (27 de marzo de 2014). "Se aclama el avance del ADN sintético" . BBC News . Consultado el 11 de abril de 2020 .
- ^ Kimoto M, Yamashige R, Matsunaga K, Yokoyama S, Hirao I (mayo de 2013). "Generación de aptámeros de ADN de alta afinidad utilizando un alfabeto genético expandido". Biotecnología de la naturaleza . 31 (5): 453–7. doi : 10.1038 / nbt.2556 . PMID 23563318 . S2CID 23329867 .
- ^ Malyshev DA, Dhami K, Quach HT, Lavergne T, Ordoukhanian P, Torkamani A, Romesberg FE (julio de 2012). "La replicación eficiente e independiente de la secuencia del ADN que contiene un tercer par de bases establece un alfabeto genético funcional de seis letras" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 109 (30): 12005–10. Código bibliográfico : 2012PNAS..10912005M . doi : 10.1073 / pnas.1205176109 . PMC 3409741 . PMID 22773812 .
- ^ Malyshev DA, Dhami K, Lavergne T, Chen T, Dai N, Foster JM, et al. (Mayo de 2014). "Un organismo semisintético con un alfabeto genético expandido" . Naturaleza . 509 (7500): 385–8. Código Bibliográfico : 2014Natur.509..385M . doi : 10.1038 / nature13314 . PMC 4058825 . PMID 24805238 .
- ^ a b Fuhrmann M, Oertel W, Hegemann P (agosto de 1999). "Un gen sintético que codifica la proteína verde fluorescente (GFP) es un reportero versátil en Chlamydomonas reinhardtii". The Plant Journal . 19 (3): 353–61. doi : 10.1046 / j.1365-313X.1999.00526.x . PMID 10476082 .
- ^ Mandecki W, Bolling TJ (agosto de 1988). "Método FokI de síntesis de genes". Gene . 68 (1): 101–7. doi : 10.1016 / 0378-1119 (88) 90603-8 . PMID 3265397 .
- ^ Stemmer WP, Crameri A, Ha KD, Brennan TM, Heyneker HL (octubre de 1995). "Ensamblaje de un solo paso de un gen y plásmido completo de un gran número de oligodesoxirribonucleótidos". Gene . 164 (1): 49–53. doi : 10.1016 / 0378-1119 (95) 00511-4 . PMID 7590320 .
- ^ Gao X, Yo P, Keith A, Ragan TJ, Harris TK (noviembre de 2003). "Síntesis de genes basada en PCR de adentro hacia afuera (TBIO) equilibrada termodinámicamente: un método novedoso de diseño de cebadores para el ensamblaje de alta fidelidad de secuencias de genes más largas" . Investigación de ácidos nucleicos . 31 (22): 143e – 143. doi : 10.1093 / nar / gng143 . PMC 275580 . PMID 14602936 .
- ^ Young L, Dong Q (abril de 2004). "Método de síntesis génica total de dos pasos" . Investigación de ácidos nucleicos . 32 (7): e59. doi : 10.1093 / nar / gnh058 . PMC 407838 . PMID 15087491 .
- ^ Hillson NJ, Rosengarten RD, Keasling JD (enero de 2012). "Software de automatización de diseño de ensamblaje de ADN j5" . Biología sintética ACS . 1 (1): 14-21. doi : 10.1021 / sb2000116 . PMID 23651006 .
- ^ Hoover DM, Lubkowski J (mayo de 2002). "DNAWorks: un método automatizado para el diseño de oligonucleótidos para la síntesis de genes basada en PCR" . Investigación de ácidos nucleicos . 30 (10): 43e – 43. doi : 10.1093 / nar / 30.10.e43 . PMC 115297 . PMID 12000848 .
- ^ Villalobos A, Ness JE, Gustafsson C, Minshull J, Govindarajan S (junio de 2006). "Gene Designer: una herramienta de biología sintética para la construcción de segmentos de ADN artificiales" . BMC Bioinformática . 7 : 285. doi : 10.1186 / 1471-2105-7-285 . PMC 1523223 . PMID 16756672 .
- ^ Tian J, Gong H, Sheng N, Zhou X, Gulari E, Gao X, Church G (diciembre de 2004). "Síntesis de genes multiplex precisa a partir de microchips de ADN programables" (PDF) . Naturaleza . 432 (7020): 1050–4. Código Bibliográfico : 2004Natur.432.1050T . doi : 10.1038 / nature03151 . hdl : 2027,42 / 62677 . PMID 15616567 . S2CID 4373350 .
- ^ Matzas M, Stähler PF, Kefer N, Siebelt N, Boisguérin V, Leonard JT, et al. (Diciembre de 2010). "Síntesis de genes de alta fidelidad mediante la recuperación de ADN verificado por secuencia identificado mediante pirosecuenciación de alto rendimiento" . Biotecnología de la naturaleza . 28 (12): 1291–4. doi : 10.1038 / nbt.1710 . PMC 3579223 . PMID 21113166 .
- ^ Schwartz JJ, Lee C, Shendure J (septiembre de 2012). "Síntesis de genes precisa con recuperación dirigida por etiquetas de moléculas de ADN verificadas en secuencia" . Métodos de la naturaleza . 9 (9): 913–5. doi : 10.1038 / nmeth.2137 . PMC 3433648 . PMID 22886093 .
- ^ Weidman C (6 de diciembre de 2017). "Ampliando el alfabeto genético" . Blog . Universidad de Harvard . Consultado el 17 de abril de 2020 .
- ^ "Ayuda: Biología sintética - parts.igem.org" . parts.igem.org . Consultado el 11 de abril de 2020 .
- ^ a b c Casini A, Storch M, Baldwin GS, Ellis T (septiembre de 2015). "Ladrillos y planos: métodos y estándares para el ensamblaje de ADN" . Reseñas de la naturaleza. Biología celular molecular . 16 (9): 568–76. doi : 10.1038 / nrm4014 . hdl : 10044/1/31281 . PMID 26081612 . S2CID 3502437 .
- ^ Caballero T (2003). "Diseño vectorial idempotente para ensamblaje estándar de bioladrillos". hdl : 1721,1 / 21168 . Cite journal requiere
|journal=
( ayuda ) - ^ Røkke G, Korvald E, Pahr J, Oyås O, Lale R (2014). "Estándares y técnicas de montaje de BioBrick y herramientas de software asociadas". En Valla S, Lale R (eds.). Métodos de clonación y ensamblaje de ADN . Métodos en Biología Molecular. 1116 . Clifton, Nueva Jersey págs. 1–24. doi : 10.1007 / 978-1-62703-764-8_1 . ISBN 978-1-62703-763-1. PMID 24395353 .
- ^ Knight T (19 de noviembre de 2008). "Proyecto de Norma para Biobrick BB-2 Biological Parts". hdl : 1721,1 / 45139 . Cite journal requiere
|journal=
( ayuda ) - ^ Anderson JC, Dueber JE, Leguia M, Wu GC, Goler JA, Arkin AP, Keasling JD (enero de 2010). "BglBricks: un estándar flexible para el ensamblaje de piezas biológicas" . Revista de Ingeniería Biológica . 4 (1): 1. doi : 10.1186 / 1754-1611-4-1 . PMC 2822740 . PMID 20205762 .
- ^ Phillips I, Silver P (20 de abril de 2006). "Una nueva estrategia de ensamblaje de bioladrillos diseñada para la ingeniería de proteínas fácil". hdl : 1721,1 / 32535 . Cite journal requiere
|journal=
( ayuda ) - ^ Grünberg R, Arndt K, Müller K (18 de abril de 2009). "Estándar de ensamblaje de Biobrick Fusion Protein (Freiburg)". hdl : 1721,1 / 45140 . Cite journal requiere
|journal=
( ayuda ) - ^ Shetty R, Lizarazo M, Rettberg R, Knight TF (2011). "Montaje de piezas biológicas estándar de BioBrick mediante montaje de tres antibióticos". Métodos en enzimología . 498 : 311-26. doi : 10.1016 / B978-0-12-385120-8.00013-9 . hdl : 1721,1 / 65066 . ISBN 9780123851208. PMID 21601683 .
- ^ Speer MA, Richard TL (diciembre de 2011). "Ensamblaje de inserto amplificado: un enfoque optimizado para el ensamblaje estándar de circuitos genéticos BioBrickTM" . Revista de Ingeniería Biológica . 5 (1): 17. doi : 10.1186 / 1754-1611-5-17 . PMC 3287150 . PMID 22176971 .
- ^ a b Li MV, Shukla D, Rhodes BH, Lall A, Shu J, Moriarity BS, Largaespada DA (24 de junio de 2014). "HomeRun Vector Assembly System: un sistema de clonación flexible y estandarizado para el ensamblaje de construcciones de ADN multimodulares" . PLOS ONE . 9 (6): e100948. Código bibliográfico : 2014PLoSO ... 9j0948L . doi : 10.1371 / journal.pone.0100948 . PMC 4069157 . PMID 24959875 .
- ^ Liu JK, Chen WH, Ren SX, Zhao GP, Wang J (20 de octubre de 2014). "iBrick: un nuevo estándar para el ensamblaje iterativo de partes biológicas con endonucleasas autodirigidas" . PLOS ONE . 9 (10): e110852. Código Bibliográfico : 2014PLoSO ... 9k0852L . doi : 10.1371 / journal.pone.0110852 . PMC 4203835 . PMID 25329380 .
- ^ a b Engler C, Kandzia R, Marillonnet S (5 de noviembre de 2008). "Un método de clonación de precisión de un solo paso, un solo paso, con alta capacidad de rendimiento" . PLOS ONE . 3 (11): e3647. Código Bibliográfico : 2008PLoSO ... 3.3647E . doi : 10.1371 / journal.pone.0003647 . PMC 2574415 . PMID 18985154 .
- ^ Weber E, Engler C, Gruetzner R, Werner S, Marillonnet S (febrero de 2011). "Un sistema de clonación modular para el ensamblaje estandarizado de construcciones multigénicas" . PLOS ONE . 6 (2): e16765. Código Bibliográfico : 2011PLoSO ... 616765W . doi : 10.1371 / journal.pone.0016765 . PMC 3041749 . PMID 21364738 .
- ^ Klein CA, Emde L, Kuijpers A, Sobetzko P (17 de octubre de 2019). "MoCloFlex: un sistema de clonación modular pero flexible" . Fronteras en Bioingeniería y Biotecnología . 7 : 271. doi : 10.3389 / fbioe.2019.00271 . PMC 6843054 . PMID 31750294 .
- ^ Moore SJ, Lai HE, Kelwick RJ, Chee SM, Bell DJ, Polizzi KM, Freemont PS (octubre de 2016). "EcoFlex: un kit MoClo multifuncional para la biología sintética de E. coli" . Biología sintética ACS . 5 (10): 1059–1069. doi : 10.1021 / acssynbio.6b00031 . PMID 27096716 .
- ^ Crozet P, Navarro FJ, Willmund F, Mehrshahi P, Bakowski K, Lauersen KJ, et al. (Septiembre de 2018). "Nacimiento de un chasis fotosintético: un kit de herramientas MoClo que permite la biología sintética en la microalga Chlamydomonas reinhardtii" . Biología sintética ACS . 7 (9): 2074-2086. doi : 10.1021 / acssynbio.8b00251 . PMID 30165733 .
- ^ Reece-Hoyes JS, Walhout AJ (enero de 2018). "Clonación recombinacional de puerta de enlace" . Protocolos de Cold Spring Harbor . 2018 (1): pdb.top094912. doi : 10.1101 / pdb.top094912 . PMC 5935001 . PMID 29295908 .
- ^ Sasaki Y, Sone T, Yoshida S, Yahata K, Hotta J, Chesnut JD, et al. (Febrero de 2004). "Evidencia de alta especificidad y eficiencia de múltiples señales de recombinación en la clonación de ADN mixto por el sistema Multisite Gateway" . Revista de Biotecnología . 107 (3): 233–43. doi : 10.1016 / j.jbiotec.2003.10.001 . PMID 14736459 .
- ^ Colloms SD, Merrick CA, Olorunniji FJ, Stark WM, Smith MC, Osbourn A, et al. (Febrero 2014). "Ensamblaje y modificación de la vía metabólica rápida mediante recombinación específica de sitio de serina integrasa" . Investigación de ácidos nucleicos . 42 (4): e23. doi : 10.1093 / nar / gkt1101 . PMC 3936721 . PMID 24225316 .
- ^ Zhang L, Zhao G, Ding X (3 de noviembre de 2011). "Ensamblaje en tándem del grupo de genes biosintéticos de epotilona por recombinación in vitro específica del sitio" . Informes científicos . 1 (1): 141. Código Bibliográfico : 2011NatSR ... 1E.141Z . doi : 10.1038 / srep00141 . PMC 3216622 . PMID 22355658 .
- ^ Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO (mayo de 2009). "Ensamblaje enzimático de moléculas de ADN de hasta varios cientos de kilobases" . Métodos de la naturaleza . 6 (5): 343–5. doi : 10.1038 / nmeth.1318 . PMID 19363495 . S2CID 1351008 .
- ^ Quan J, Tian J (julio de 2009). "Clonación de extensión de polimerasa circular de rutas y bibliotecas de genes complejos" . PLOS ONE . 4 (7): e6441. Código Bibliográfico : 2009PLoSO ... 4.6441Q . doi : 10.1371 / journal.pone.0006441 . PMC 2713398 . PMID 19649325 .
- ^ Li MZ, Elledge SJ (marzo de 2007). "Aprovechamiento de la recombinación homóloga in vitro para generar ADN recombinante a través de SLIC" . Métodos de la naturaleza . 4 (3): 251–6. doi : 10.1038 / nmeth1010 . PMID 17293868 . S2CID 30893882 .
- ^ Zhang Y, Werling U, Edelmann W (abril de 2012). "SLiCE: un nuevo método de clonación de ADN basado en extracto de células bacterianas" . Investigación de ácidos nucleicos . 40 (8): e55. doi : 10.1093 / nar / gkr1288 . PMC 3333860 . PMID 22241772 .
- ^ "Cómo Gibson Assembly® está cambiando la biología sintética" . New England Biolabs . Consultado el 14 de abril de 2020 .
- ^ Casini A, MacDonald JT, De Jonghe J, Christodoulou G, Freemont PS, Baldwin GS, Ellis T (enero de 2014). "Construcción de ADN de un solo recipiente para biología sintética: la estrategia de ensamblaje modular dirigido por superposición con enlazadores (MODAL)" . Investigación de ácidos nucleicos . 42 (1): e7. doi : 10.1093 / nar / gkt915 . PMC 3874208 . PMID 24153110 .
- ^ a b c d Storch M, Casini A, Mackrow B, Fleming T, Trewhitt H, Ellis T, Baldwin GS (julio de 2015). "BÁSICO: un nuevo estándar de ensamblaje de biopartes para clonación idempotente proporciona un ensamblaje de ADN de un solo nivel preciso para biología sintética" . Biología sintética ACS . 4 (7): 781–7. doi : 10.1021 / sb500356d . PMID 25746445 .
- ^ "Protocolo de montaje de Gibson" . Addgene . Consultado el 14 de abril de 2020 .
- ^ El Karoui M, Hoyos-Flight M, Fletcher L (2019). "Tendencias futuras en el informe de biología sintética-A" . Fronteras en Bioingeniería y Biotecnología . 7 : 175. doi : 10.3389 / fbioe.2019.00175 . PMC 6692427 . PMID 31448268 .
- ^ Kosuri S, Church GM (mayo de 2014). "Síntesis de ADN de novo a gran escala: tecnologías y aplicaciones" (PDF) . Métodos de la naturaleza . 11 (5): 499–507. doi : 10.1038 / nmeth.2918 . PMC 7098426 . PMID 24781323 .
- ^ Lartigue C, Glass JI, Alperovich N, Pieper R, Parmar PP, Hutchison CA, et al. (Agosto de 2007). "Trasplante de genoma en bacterias: cambio de una especie a otra". Ciencia . 317 (5838): 632–8. Código Bibliográfico : 2007Sci ... 317..632L . CiteSeerX 10.1.1.395.4374 . doi : 10.1126 / science.1144622 . PMID 17600181 . S2CID 83956478 .
- ^ Pilkington E (6 de octubre de 2009). "Estoy creando vida artificial", declara pionero genético estadounidense " . The Guardian . Londres. Archivado desde el original el 28 de mayo de 2010 . Consultado el 22 de mayo de 2010 .
- ^ Pennisi, E. (21 de mayo de 2010). "El genoma sintético trae nueva vida a las bacterias" (PDF) . Ciencia . 328 (5981): 958–9. doi : 10.1126 / science.328.5981.958 . PMID 20488994 . Archivado (PDF) desde el original el 25 de mayo de 2010 . Consultado el 21 de mayo de 2010 .
- ^ "Cómo los científicos hicieron 'vida artificial ' " . BBC News . 2010-05-20. Archivado desde el original el 1 de junio de 2013 . Consultado el 21 de mayo de 2010 .
- ^ "Levadura 2.0" . Colección Nature Communications . Springer Nature Limited . Consultado el 17 de abril de 2020 .
- ^ Shukman D (27 de marzo de 2014). "Los científicos saludan el avance de los cromosomas sintéticos" . BBC News . Consultado el 28 de marzo de 2014 .
- ^ Annaluru N, Muller H, Mitchell LA, Ramalingam S, Stracquadanio G, Richardson SM, et al. (Abril de 2014). "Síntesis total de un cromosoma eucariota de diseño funcional" . Ciencia . 344 (6179): 55–8. Código bibliográfico : 2014Sci ... 344 ... 55A . doi : 10.1126 / science.1249252 . PMC 4033833 . PMID 24674868 .
- ^ Número especial GENOMA DE LEVADURA SINTÉTICA Ciencia 10 de marzo de 2017 Vol 355, Número 6329