El inmunomarcaje es un proceso bioquímico que permite la detección y localización de un antígeno en un sitio particular dentro de una célula, tejido u órgano. Los antígenos son moléculas orgánicas, generalmente proteínas , capaces de unirse a un anticuerpo . Estos antígenos se pueden visualizar usando una combinación de anticuerpos específicos de antígeno, así como un medio de detección, llamado etiqueta, que está unido covalentemente al anticuerpo. [1] Si el proceso de inmunomarcaje está destinado a revelar información sobre una célula o sus subestructuras, el proceso se denomina inmunocitoquímica . [2] El inmunomarcaje de estructuras más grandes se denomina inmunohistoquímica . [3]
Hay dos pasos complejos en la fabricación de anticuerpos para inmunomarcaje. El primero es producir el anticuerpo que se une específicamente al antígeno de interés y el segundo es fusionar la etiqueta con el anticuerpo. Dado que no es práctico fusionar una etiqueta con cada anticuerpo específico de antígeno concebible, la mayoría de los procesos de inmunomarcaje utilizan un método indirecto de detección. Este método indirecto emplea un anticuerpo primario que es específico de antígeno y un anticuerpo secundario fusionado a una etiqueta que se une específicamente al anticuerpo primario. Este enfoque indirecto permite la producción en masa de anticuerpos secundarios que se pueden comprar en el mercado. [4] De acuerdo con este método indirecto, el anticuerpo primario se agrega al sistema de prueba. El anticuerpo primario busca y se une al antígeno diana. Posteriormente se agrega el anticuerpo secundario etiquetado, diseñado para unirse exclusivamente al anticuerpo primario.
Las etiquetas típicas incluyen: un compuesto fluorescente , perlas de oro, una etiqueta de epítopo particular , [5] o una enzima que produce un compuesto coloreado. La asociación de las etiquetas a la diana a través de los anticuerpos permite la identificación y visualización del antígeno de interés en su ubicación nativa en el tejido, como la membrana celular , el citoplasma o la membrana nuclear . En determinadas condiciones, el método se puede adaptar para proporcionar información cuantitativa. [4]
El inmunomarcaje se puede utilizar en farmacología , biología molecular , bioquímica y cualquier otro campo en el que sea importante conocer la ubicación precisa de una molécula que se une a un anticuerpo. [6] [7] [8]
Método indirecto vs. directo
Hay dos métodos implicados en el inmunomarcaje, el directo y el indirecto. En el método directo de inmunomarcaje, el anticuerpo primario se conjuga directamente con la etiqueta. [9] El método directo es útil para minimizar la reacción cruzada , una medida de no especificidad que es inherente a todos los anticuerpos y que se multiplica con cada anticuerpo adicional utilizado para detectar un antígeno. Sin embargo, el método directo es mucho menos práctico que el método indirecto y no se usa comúnmente en los laboratorios, ya que los anticuerpos primarios deben marcarse covalentemente, lo que requiere un suministro abundante de anticuerpo purificado. Además, el método directo es potencialmente mucho menos sensible que el método indirecto. [10] Dado que varios anticuerpos secundarios son capaces de unirse a diferentes partes, o dominios, de un único anticuerpo primario que se une al antígeno diana, hay más anticuerpos etiquetados asociados con cada antígeno. Más etiqueta por antígeno da como resultado más señal por antígeno. [11]
Pueden emplearse diferentes métodos indirectos para lograr altos grados de especificidad y sensibilidad. En primer lugar, los protocolos de dos pasos se utilizan a menudo para evitar la reacción cruzada entre el inmunomarcaje de múltiples mezclas de anticuerpos primarios y secundarios , donde se utilizan con frecuencia anticuerpos de unión a antígenos de fragmentos secundarios . En segundo lugar, pueden usarse anticuerpos primarios haptenilados, donde el anticuerpo secundario puede reconocer el hapteno asociado . El hapteno se une covalentemente al anticuerpo primario mediante succinil imidasteres o secciones de Fab específicas de Fc de IgG conjugadas . Por último, los anticuerpos monoclonales primarios que tienen diferentes isotipos de Ig pueden detectarse mediante anticuerpos secundarios específicos que están contra el isotipo de interés. [10]
Unión y especificidad de anticuerpos
En general, los anticuerpos deben unirse a los antígenos con una alta especificidad y afinidad. [12] La especificidad de la unión se refiere a la capacidad de un anticuerpo para unirse y unirse a un único antígeno diana. Los científicos suelen utilizar anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales , que se componen de péptidos sintéticos. Durante la fabricación de estos anticuerpos, los anticuerpos específicos de antígeno se secuestran uniendo el péptido antigénico a una columna de afinidad y permitiendo que el anticuerpo inespecífico simplemente pase a través de la columna. Esto disminuye la probabilidad de que los anticuerpos se unan a un epítopo no deseado del antígeno que no se encuentra en el péptido inicial. Por tanto, la especificidad del anticuerpo se establece mediante la reacción específica con la proteína o péptido que se utiliza para la inmunización mediante métodos específicos, como la inmunotransferencia o la inmunoprecipitación . [13]
Al establecer la especificidad de los anticuerpos, el factor clave es el tipo de péptidos sintéticos o proteínas purificadas que se utilizan. Cuanto menor sea la especificidad del anticuerpo, mayor será la posibilidad de visualizar algo diferente al antígeno diana. En el caso de los péptidos sintéticos, la ventaja es que la secuencia de aminoácidos es fácilmente accesible, pero los péptidos no siempre se parecen a la estructura tridimensional o la modificación postraduccional encontrada en la forma nativa de la proteína. Por lo tanto, los anticuerpos que se producen para actuar contra un péptido sintético pueden tener problemas con la proteína 3-D nativa. Estos tipos de anticuerpos conducirían a resultados deficientes en experimentos de inmunoprecipitación o inmunohistoquímica , aunque los anticuerpos pueden ser capaces de unirse a la forma desnaturalizada de la proteína durante una prueba de inmunotransferencia. Por el contrario, si el anticuerpo funciona bien para proteínas purificadas en su forma nativa y no desnaturalizadas , una inmunotransferencia no puede usarse como prueba estandarizada para determinar la especificidad de la unión del anticuerpo, particularmente en inmunohistoquímica. [14]
Técnicas específicas de inmunomarcaje
Inmunomarcado para microscopía óptica
La microscopía óptica es el uso de un microscopio óptico , que es un instrumento que requiere el uso de luz para ver la muestra ampliada. En general, se usa con frecuencia un microscopio óptico compuesto, donde dos lentes, el ocular y el objetivo funcionan simultáneamente para generar el aumento de la muestra. [15] La microscopía óptica utiliza con frecuencia el inmunomarcaje para observar tejidos o células objetivo. Por ejemplo, se realizó un estudio para ver la morfología y la producción de hormonas en cultivos de células de adenoma pituitario mediante microscopía óptica y otros métodos de microscopía electrónica. Este tipo de microscopía confirmó que los cultivos de células de adenoma primario mantienen sus características fisiológicas in vitro , que coincidieron con la inspección histológica. Además, se observaron cultivos celulares de adenomas pituitarios humanos mediante microscopía óptica e inmunocitoquímica, donde estas células se fijaron e inmunomarcaron con un anticuerpo monoclonal de ratón contra GH humana y un anticuerpo policlonal de conejo contra PRL. Este es un ejemplo de cómo un cultivo celular inmunomarcado de células de adenoma hipofisario que se observaron mediante microscopía óptica y otras técnicas de microscopía electrónica puede ayudar con el diagnóstico adecuado de tumores. [dieciséis]
Inmunomarcado para microscopía electrónica
La microscopía electrónica (EM) es un área de la ciencia enfocada que utiliza el microscopio electrónico como herramienta para ver tejidos. [17] La microscopía electrónica tiene un nivel de aumento de hasta 2 millones de veces, mientras que la microscopía óptica solo tiene un aumento de hasta 1000-2000 veces. [18] Hay dos tipos de microscopios electrónicos, el microscopio electrónico de transmisión y el microscopio electrónico de barrido . [17]
La microscopía electrónica es un método común que utiliza la técnica de inmunomarcaje para ver tejidos o células marcados. El método del microscopio electrónico sigue muchos de los mismos conceptos que el inmunomarcaje para microscopía óptica, donde el anticuerpo en particular es capaz de reconocer la ubicación del antígeno de interés y luego ser visto por el microscopio electrónico. La ventaja de la microscopía electrónica sobre la microscopía óptica es la capacidad de ver las áreas objetivo en su nivel subcelular. Generalmente, un metal pesado que es denso en electrones se usa para EM, que puede reflejar los electrones incidentes. El inmunomarcaje se confirma típicamente usando el microscopio óptico para asegurar la presencia del antígeno y luego se realiza un seguimiento con el microscopio electrónico. [19]
El inmunomarcaje y la microscopía electrónica se utilizan a menudo para ver los cromosomas . Se realizó un estudio para ver posibles mejoras de las estructuras cromosómicas de inmunomarcaje, como la topoisomerasa IIα y la condensina en cromosomas mitóticos disecados . En particular, estos investigadores utilizaron irradiación UV de núcleos separados o mostraron cómo los cromosomas ayudan mediante altos niveles de inmunomarcaje específico, que fueron vistos por microscopía electrónica. [20]
Inmunomarcado para microscopía electrónica de transmisión
La microscopía electrónica de transmisión (TEM) utiliza un microscopio electrónico de transmisión para formar una imagen bidimensional disparando electrones a través de un trozo delgado de tejido. Cuanto más brillantes sean determinadas áreas de la imagen, más electrones podrán moverse a través de la muestra. [17] La microscopía electrónica de transmisión se ha utilizado como una forma de ver tejidos y células inmunomarcados. Por ejemplo, las bacterias pueden verse mediante TEM cuando se aplica el inmunomarcaje. Se realizó un estudio para examinar las estructuras de las fimbrias CS3 y CS6 en diferentes cepas de Escherichia coli , que fueron detectadas por TEM seguido de tinción negativa e inmunomarcaje. Más específicamente, el inmunomarcaje de las fimbrias confirmó la existencia de diferentes antígenos de superficie. [21]
Inmunomarcado para microscopía electrónica de barrido
La microscopía electrónica de barrido (SEM) utiliza un microscopio electrónico de barrido, que produce imágenes grandes que se perciben como tridimensionales cuando, de hecho, no lo son. Este tipo de microscopio concentra un haz de electrones a través de un área muy pequeña (2-3 nm) de la muestra para producir electrones a partir de dicha muestra. Estos electrones secundarios son detectados por un sensor y la imagen de la muestra se genera durante un cierto período de tiempo. [17]
La microscopía electrónica de barrido es una técnica de inmunomarcaje de uso frecuente. SEM es capaz de detectar la superficie de componentes celulares en alta resolución. Esta técnica de inmunomarcaje es muy similar al método de inmunofluorescencia, pero se utiliza una etiqueta de oro coloidal en lugar de un fluoróforo. En general, los conceptos son muy paralelos en el sentido de que se usa un anticuerpo primario no conjugado y se sigue secuencialmente por un anticuerpo secundario etiquetado que actúa contra el anticuerpo primario. [22] A veces, el SEM junto con el inmunomarcaje de partículas de oro es problemático en lo que respecta a la resolución de las partículas y cargas bajo el haz de electrones; sin embargo, este revés en la resolución se ha resuelto mediante la mejora de la instrumentación SEM mediante imágenes de electrones retrodispersados. [23] Esto se debe a que los patrones de difracción de retrodispersión de electrones proporcionan una superficie limpia de la muestra para interactuar con el haz de electrones primario. [24]
Inmunoetiquetado con oro (Immunogold Labeling)
El inmunomarcaje con partículas de oro, también conocido como tinción por inmunoold , se usa regularmente con microscopía electrónica de barrido y microscopía electrónica de transmisión para identificar con éxito el área dentro de las células y tejidos donde se encuentran los antígenos. [23] La técnica de etiquetado de partículas de oro fue publicada por primera vez por Faulk, W. y Taylor, G. cuando pudieron etiquetar partículas de oro en gammaglobulinas de conejo contra la salmonela en un solo paso para identificar la ubicación de los antígenos de la salmonela. . [23] [25]
Los estudios han demostrado que el tamaño de la partícula de oro debe agrandarse (> 40 nm) para ver las células con un aumento bajo, pero las partículas de oro que son demasiado grandes pueden disminuir la eficiencia de la unión de la etiqueta de oro. Los científicos han concluido que el uso de partículas de oro más pequeñas (1-5 nm) debería ampliarse y mejorarse con plata. Aunque la tinción con tetróxido de osmio puede rayar la plata, se encontró que la mejora de las partículas de oro no era susceptible de rayarse por la tinción con tetróxido de osmio; por lo tanto, muchos estudios de adhesión celular de diferentes sustratos pueden utilizar el mecanismo de marcaje inmunológico mediante la mejora de las partículas de oro. [26]
Referencias
- ^ Hyatt, AD y Wise, TG (2001). "Inmunoetiquetado". Inmunocitoquímica e hibridación in situ en las ciencias biomédicas - Capítulo 5 - Inmunomarcado . Boston, MA: Birkhauser Boston. págs. 73-107. doi : 10.1007 / 978-1-4612-0139-7_5 . ISBN 978-1-46-12-0139-7.
- ^ Nanci A, Wazen R, Nishio C, Zalzal SF (2008). "Inmunocitoquímica de proteínas de matriz en tejidos calcificados: bioquímica funcional en sección" . Eur J Histochem . 52 (4): 201-14. doi : 10.4081 / 1218 . PMID 19109094 .
- ^ Swanson PE (septiembre de 1988). "Fundamentos de la inmunohistoquímica. Una revisión práctica" . Soy. J. Clin. Pathol . 90 (3): 333–9. doi : 10.1093 / ajcp / 90.3.333 . PMID 3046324 .
- ^ a b Rapley R, Walker JM, eds. (2008). Manual de biometodos moleculares (2ª ed.). Totowa, Nueva Jersey: Humana Press. pag. 1066. ISBN 978-1-60327-370-1.
- ^ Pang J, Zeng X, Xiao RP, Lakatta EG, Lin L (junio de 2009). "Diseño, generación y prueba de módulos de expresión de mamíferos que etiquetan proteínas de membrana" . Protein Sci . 18 (6): 1261–71. doi : 10.1002 / pro.136 . PMC 2774436 . PMID 19472344 .
- ^ Rangell LK, Keller GA (agosto de 2000). "Aplicación de la tecnología de microondas al procesamiento e inmunomarcaje de criosecciones incrustadas en plástico" . Revista de histoquímica y citoquímica . 48 (8): 1153–9. doi : 10.1177 / 002215540004800812 . PMID 10898808 .
- ^ Malecki M, Hsu A, Truong L, Sanchez S (enero de 2002). "Inmunomarcado molecular con anticuerpos recombinantes de fragmento variable monocatenario (scFv) diseñados con dominios de unión a metales" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 99 (1): 213–8. Código Bibliográfico : 2002PNAS ... 99..213M . doi : 10.1073 / pnas.261567298 . PMC 117541 . PMID 11756693 .
- ^ Haycock JW (septiembre de 1989). "Cuantificación de tirosina hidroxilasa, niveles de proteínas: inmunomarcaje de manchas con un anticuerpo purificado por afinidad". Bioquímica analítica . 181 (2): 259–66. doi : 10.1016 / 0003-2697 (89) 90240-6 . PMID 2573292 .
- ^ Chandler, Douglas E .; Roberson, Robert W. (2009). Bioimagen: conceptos actuales en microscopía óptica y electrónica . Sudbury, Mass .: Jones and Bartlett Publishers. pag. 311. ISBN 978-0-7637-3874-7.
- ^ a b Buchwalow IB, Minin EA, Boecker W (2005). "Una técnica de inmunotinción de fluorescencia multicolor para el direccionamiento simultáneo de antígenos". Acta Histochem . 107 (2): 143–8. doi : 10.1016 / j.acthis.2005.01.003 . PMID 15950054 .
- ^ Ramos-Vara JA (julio de 2005). "Aspectos técnicos de la inmunohistoquímica". Veterinario. Pathol . 42 (4): 405–26. doi : 10.1354 / vp.42-4-405 . PMID 16006601 . S2CID 6229029 .
- ^ Kumagai I, Tsumoto K (19 de abril de 2010). Unión antígeno-anticuerpo . eLS . págs. 1-7. doi : 10.1002 / 9780470015902.a0001117.pub2 . ISBN 978-0470016176.
- ^ Burry RW (febrero de 2000). "Controles de especificidad para métodos inmunocitoquímicos" . J. Histochem. Cytochem . 48 (2): 163–6. doi : 10.1177 / 002215540004800201 . PMID 10639482 .
- ^ Bordeaux J, Welsh A, Agarwal S, Killiam E, Baquero M, Hanna J, Anagnostou V, Rimm D (marzo de 2010). "Validación de anticuerpos" . BioTechniques . 48 (3): 197-209. doi : 10.2144 / 000113382 . PMC 3891910 . PMID 20359301 .
- ^ Murphy, Douglas B. Davidson; Michael W. (2013). Fundamentos de microscopía óptica e imágenes electrónicas (Segunda ed.). Hoboken, Nueva Jersey: John Wiley and Sons, Inc. págs. 1-2. ISBN 978-0-471-69214-0.
- ^ Fazekas I, Hegedüs B, Bácsy E, et al. (2005). "Caracterización de adenomas hipofisarios humanos en cultivos celulares por morfología microscópica óptica y electrónica e inmunomarcaje". Folia Histochemica et Cytobiologica . 43 (2): 81–90. PMID 16044945 .
- ^ a b c d Russell, John J. Bozzola; Lonnie D. (1999). Microscopía electrónica: principios y técnicas para biólogos (2ª edición) (2. ed.). Sudbury, Mass. [Ua]: Jones y Bartlett. págs. 5 y 9. ISBN 978-0-7637-0192-5.
- ^ Kim, Oliver (22 de enero de 2009). "Microscopios electrónicos frente a microscopios ópticos (de luz)" . Revista de microscopía Microbehunter . Consultado el 4 de mayo de 2013 .
- ^ George, Andrew JT; Urch, Catherine E. (2000). Anticuerpos diagnósticos y terapéuticos . Totowa, Nueva Jersey: Humana Press. págs. 439–452. ISBN 9781592590766.
- ^ Maeshima K, Eltsov M, Laemmli UK (noviembre de 2005). "Estructura cromosómica: inmunomarcaje mejorado para microscopía electrónica" (PDF) . Cromosoma . 114 (5): 365–75. doi : 10.1007 / s00412-005-0023-7 . PMID 16175370 . S2CID 14768368 .
- ^ Lüdi S, Frey J, Favre D, Stoffel MH (abril de 2006). "Evaluación de la expresión de antígenos de superficie específicos de Escherichia coli enterotoxigénicos en cepas recombinantes mediante microscopía electrónica de transmisión e inmunomarcaje" . J. Histochem. Cytochem . 54 (4): 473–7. doi : 10.1369 / jhc.5A6794.2005 . PMID 16344328 .
- ^ Goldberg MW (2008). Inmunomarcado para microscopía electrónica de barrido (SEM) y emisión de campo SEM . Métodos Cell Biol . Métodos en biología celular. 88 . págs. 109-30. doi : 10.1016 / S0091-679X (08) 00407-X . ISBN 9780123743206. PMID 18617031 .
- ^ a b c Rosso F, Papale F, Barbarisi A (2013). "Inmunoetiquetado de oro de microscopía electrónica de barrido ambiental en biología celular". Técnicas de imagen celular . Métodos en Biología Molecular. 931 . págs. 517-23. doi : 10.1007 / 978-1-62703-056-4_27 . ISBN 978-1-62703-055-7. PMID 23027021 .
- ^ Narayanan BK, Kovarik L, Quintana MA, Mills MJ (2013). "Caracterización de microestructuras de soldadura ferrítica mediante diversas técnicas de microscopía electrónica: una revisión". Ciencia y Tecnología de Soldadura y Uniones . 16 (1): 12-22. doi : 10.1179 / 136217110X12720264008312 . ISSN 1362-1718 . S2CID 135581795 .
- ^ Faulk WP, Taylor GM (noviembre de 1971). "Un método inmunocoloide para el microscopio electrónico". Inmunoquímica . 8 (11): 1081–3. doi : 10.1016 / 0019-2791 (71) 90496-4 . PMID 4110101 .
- ^ Owen GR, Meredith DO, Ap Gwynn I, Richards RG (2001). "Mejora de los sitios de adhesión focal marcados con inmuno oro en fibroblastos cultivados en sustratos metálicos: problemas y soluciones". Cell Biol. Int . 25 (12): 1251–9. doi : 10.1006 / cbir.2001.0846 . PMID 11748918 .
enlaces externos
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