La inmunoprecipitación ( IP ) es la técnica de precipitar un antígeno proteico de la solución utilizando un anticuerpo que se une específicamente a esa proteína en particular. Este proceso se puede utilizar para aislar y concentrar una proteína particular de una muestra que contiene muchos miles de proteínas diferentes. La inmunoprecipitación requiere que el anticuerpo se acople a un sustrato sólido en algún momento del procedimiento.
Tipos
Inmunoprecipitación de proteínas individuales (IP)
Implica el uso de un anticuerpo que es específico para una proteína conocida para aislar esa proteína en particular de una solución que contiene muchas proteínas diferentes. Estas soluciones estarán a menudo en forma de lisado crudo de un tejido vegetal o animal. Otros tipos de muestras pueden ser fluidos corporales u otras muestras de origen biológico.
Inmunoprecipitación de complejos de proteínas (Co-IP)
La inmunoprecipitación de complejos proteicos intactos (es decir, el antígeno junto con cualquier proteína o ligando que esté unido a él) se conoce como co-inmunoprecipitación (Co-IP). Co-IP funciona seleccionando un anticuerpo que se dirige a una proteína conocida que se cree que es miembro de un complejo de proteínas más grande. Al apuntar a este miembro conocido con un anticuerpo, puede ser posible sacar todo el complejo de proteína de la solución y así identificar miembros desconocidos del complejo.
Esto funciona cuando las proteínas involucradas en el complejo se unen entre sí estrechamente, lo que hace posible sacar varios miembros del complejo de la solución al adherirse a un miembro con un anticuerpo. Este concepto de extraer complejos de proteínas de la solución a veces se denomina "extracción". Co-IP es una técnica poderosa que los biólogos moleculares utilizan regularmente para analizar las interacciones proteína-proteína .
- Un anticuerpo particular a menudo selecciona una subpoblación de su proteína diana que tiene el epítopo expuesto, por lo que no logra identificar ninguna proteína en los complejos que ocultan el epítopo. Esto se puede ver en que rara vez es posible precipitar incluso la mitad de una proteína dada de una muestra con un solo anticuerpo, incluso cuando se usa un gran exceso de anticuerpo.
- A medida que tienen lugar rondas sucesivas de direccionamiento e inmunoprecipitaciones, el número de proteínas identificadas puede seguir creciendo. Es posible que las proteínas identificadas no existan nunca en un solo complejo en un momento dado, sino que pueden representar una red de proteínas que interactúan entre sí en diferentes momentos para diferentes propósitos.
- Repetir el experimento apuntando a diferentes miembros del complejo de proteínas permite al investigador verificar el resultado. Cada ronda de pull-downs debería resultar en la recuperación tanto de la proteína conocida original como de otros miembros del complejo previamente identificados (e incluso nuevos miembros adicionales). Al repetir la inmunoprecipitación de esta manera, el investigador verifica que cada miembro identificado del complejo proteico sea una identificación válida. Si una proteína en particular solo puede recuperarse dirigiéndose a uno de los miembros conocidos pero no dirigiéndose a otro de los miembros conocidos, entonces el estado de esa proteína como miembro del complejo puede estar sujeto a cuestionamientos.
Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)
La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es un método utilizado para determinar la ubicación de los sitios de unión al ADN en el genoma para una proteína de interés particular . Esta técnica da una imagen de las interacciones proteína-ADN que ocurren dentro del núcleo de células o tejidos vivos . La naturaleza in vivo de este método contrasta con otros enfoques empleados tradicionalmente para responder a las mismas preguntas.
El principio que sustenta este ensayo es que las proteínas de unión al ADN (incluidos los factores de transcripción y las histonas ) en las células vivas pueden reticularse con el ADN al que se unen. Mediante el uso de un anticuerpo que es específico para una supuesta proteína de unión al ADN, se puede inmunoprecipitar el complejo proteína-ADN a partir de los lisados celulares. La reticulación se consigue a menudo aplicando formaldehído a las células (o tejido), aunque a veces es ventajoso utilizar un reticulante más definido y consistente como el peróxido de di- terc -butilo (DTBP). Después de la reticulación, las células se lisan y el ADN se rompe en pedazos de 0,2 a 1,0 kb de longitud mediante sonicación . En este punto, se realiza la inmunoprecipitación que da como resultado la purificación de los complejos proteína-ADN. Los complejos purificados de proteína-ADN luego se calientan para revertir el entrecruzamiento de formaldehído de los complejos de proteína y ADN, lo que permite que el ADN se separe de las proteínas. La identidad y la cantidad de los fragmentos de ADN aislados se pueden determinar luego mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La limitación de realizar PCR en los fragmentos aislados es que uno debe tener una idea de qué región genómica se está dirigiendo para generar los cebadores de PCR correctos. A veces, esta limitación se evita simplemente clonando el ADN genómico aislado en un vector plasmídico y luego usando cebadores que son específicos de la región de clonación de ese vector. Alternativamente, cuando se quiere encontrar dónde se une la proteína en una escala de todo el genoma, se utiliza la secuenciación de ChIP y ha surgido recientemente como una tecnología estándar que puede localizar los sitios de unión de proteínas de una manera rentable y de alto rendimiento, permitiendo también para la caracterización del cistroma . Anteriormente, también se utilizaba el microarray de ADN ( ChIP-on-chip o ChIP-chip ).
Inmunoprecipitación de RNP (RIP)
Similar a la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) descrita anteriormente, pero en lugar de dirigirse a las proteínas de unión al ADN como en el ChIP, una inmunoprecipitación de RNP se dirige a las ribonucleoproteínas (RNP). [1] Las células vivas se lisan primero y luego la proteína diana y el ARN asociado se inmunoprecipitan utilizando un anticuerpo que se dirige a la proteína de interés. Los complejos purificados de ARN-proteína se pueden separar realizando una extracción de ARN y la identidad del ARN se puede determinar mediante secuenciación de ADNc [2] o RT-PCR . Algunas variantes de RIP, como PAR-CLIP, incluyen pasos de reticulación, que luego requieren condiciones de lisis menos cuidadosas.
Proteínas etiquetadas
Uno de los principales obstáculos técnicos de la inmunoprecipitación es la gran dificultad para generar un anticuerpo que se dirija específicamente a una única proteína conocida. Para sortear este obstáculo, muchos grupos diseñarán etiquetas en el extremo C o N terminal de la proteína de interés. La ventaja aquí es que la misma etiqueta se puede usar una y otra vez en muchas proteínas diferentes y el investigador puede usar el mismo anticuerpo cada vez. Las ventajas de usar proteínas etiquetadas son tan grandes que esta técnica se ha convertido en un lugar común para todos los tipos de inmunoprecipitación, incluidos todos los tipos de IP detallados anteriormente. Ejemplos de etiquetas en uso son la etiqueta de proteína verde fluorescente (GFP), la etiqueta de glutatión-S-transferasa (GST) y la etiqueta de etiqueta FLAG . Si bien el uso de una etiqueta para habilitar los menús desplegables es conveniente, plantea algunas preocupaciones con respecto a la relevancia biológica porque la etiqueta en sí puede ocultar las interacciones nativas o introducir interacciones nuevas y no naturales.
Métodos
Los dos métodos generales de inmunoprecipitación son el método de captura directa y el método de captura indirecta.
Directo
Los anticuerpos que son específicos para una proteína particular (o grupo de proteínas) se inmovilizan sobre un sustrato en fase sólida, como microperlas superparamagnéticas o sobre microesferas de agarosa (no magnéticas) microscópicas . Las perlas con anticuerpos unidos se añaden luego a la mezcla de proteínas y las proteínas que son el objetivo de los anticuerpos se capturan en las perlas a través de los anticuerpos; en otras palabras, se inmunoprecipitan.
Indirecto
Los anticuerpos que son específicos para una proteína en particular, o un grupo de proteínas, se agregan directamente a la mezcla de proteínas. Los anticuerpos aún no se han unido a un soporte en fase sólida. Los anticuerpos pueden flotar libremente alrededor de la mezcla de proteínas y unirse a sus objetivos. A medida que pasa el tiempo, se añaden perlas recubiertas de proteína A / G a la mezcla de anticuerpo y proteína. En este punto, los anticuerpos, que ahora están unidos a sus objetivos, se adherirán a las perlas.
A partir de este momento, los protocolos directos e indirectos convergen porque las muestras ahora tienen los mismos ingredientes. Ambos métodos dan el mismo resultado final con la proteína o los complejos proteicos unidos a los anticuerpos que ellos mismos están inmovilizados sobre las perlas.
Selección
A veces se prefiere un enfoque indirecto cuando la concentración de la proteína diana es baja o cuando la afinidad específica del anticuerpo por la proteína es débil. El método indirecto también se utiliza cuando la cinética de unión del anticuerpo a la proteína es lenta por diversas razones. En la mayoría de las situaciones, el método directo es la opción predeterminada y preferida.
Avances tecnológicos
Agarosa
Históricamente, el soporte en fase sólida para la inmunoprecipitación utilizado por la mayoría de los científicos ha sido perlas de agarosa altamente porosas (también conocidas como resinas de agarosa o lodos). La ventaja de esta tecnología es una capacidad de unión potencial muy alta, ya que prácticamente toda la estructura esponjosa de la partícula de agarosa (de 50 a 150 μm de tamaño) está disponible para la unión de anticuerpos (que a su vez se unirán a las proteínas diana) y el uso de equipo de laboratorio estándar para todos los aspectos del protocolo IP sin la necesidad de ningún equipo especializado. La ventaja de una capacidad de unión extremadamente alta debe equilibrarse cuidadosamente con la cantidad de anticuerpo que el investigador está preparado para usar para recubrir las perlas de agarosa. Debido a que los anticuerpos pueden ser un factor limitante de costos, es mejor calcular hacia atrás desde la cantidad de proteína que debe capturarse (dependiendo del análisis que se realice en sentido descendente), hasta la cantidad de anticuerpo que se requiere para unir esa cantidad de proteína (con un pequeño exceso agregado para tener en cuenta las ineficiencias del sistema), y aún más a la cantidad de agarosa que se necesita para unir esa cantidad particular de anticuerpo. En los casos en que no se requiere la saturación de anticuerpos, esta tecnología no tiene rival en su capacidad para capturar cantidades extremadamente grandes de proteínas objetivo capturadas. La advertencia aquí es que la "ventaja de alta capacidad" puede convertirse en una "desventaja de alta capacidad" que se manifiesta cuando la enorme capacidad de unión de las perlas de sefarosa / agarosa no está completamente saturada con anticuerpos. A menudo sucede que la cantidad de anticuerpo disponible para el investigador para su experimento de inmunoprecipitación es menos que suficiente para saturar las perlas de agarosa que se utilizarán en la inmunoprecipitación. En estos casos, el investigador puede terminar con partículas de agarosa que solo están parcialmente recubiertas con anticuerpos, y la parte de la capacidad de unión de las perlas de agarosa que no está recubierta con anticuerpo queda libre para unirse a cualquier cosa que se adhiera, lo que resulta en un aumento señal de fondo debido a la unión no específica de los componentes del lisado a las perlas, lo que puede dificultar la interpretación de los datos. Si bien algunos pueden argumentar que por estas razones es prudente hacer coincidir la cantidad de agarosa (en términos de capacidad de unión) con la cantidad de anticuerpo que se desea unir para la inmunoprecipitación, una forma sencilla de reducir el problema de la inmunoprecipitación no específica. la unión a las perlas de agarosa y el aumento de la especificidad es para aclarar previamente el lisado, que para cualquier inmunoprecipitación es muy recomendable. [3] [4]
Preliminar
Los lisados son mezclas complejas de proteínas, lípidos, carbohidratos y ácidos nucleicos, y se debe suponer que se producirá una cierta cantidad de unión no específica al anticuerpo IP, la proteína A / G o el soporte de perlas y afectará negativamente la detección de la diana inmunoprecipitada. (s). En la mayoría de los casos, la depuración previa del lisado al comienzo de cada experimento de inmunoprecipitación (consulte el paso 2 en la sección de "protocolo" a continuación) [5] es una forma de eliminar los componentes potencialmente reactivos del lisado celular antes de la inmunoprecipitación para prevenir la falta de unión específica de estos componentes a las perlas IP o al anticuerpo. El procedimiento básico de aclarado previo se describe a continuación, en el que el lisado se incuba con perlas solas, que luego se eliminan y descartan antes de la inmunoprecipitación. [5] Sin embargo, este enfoque no tiene en cuenta la unión no específica al anticuerpo IP, que puede ser considerable. Por lo tanto, un método alternativo de aclarado previo es incubar la mezcla de proteínas con exactamente los mismos componentes que se usarán en la inmunoprecipitación, excepto que se usa un anticuerpo irrelevante no objetivo de la misma subclase de anticuerpos que el anticuerpo IP en lugar del IP. el propio anticuerpo. [4] Este enfoque intenta utilizar lo más cercano a las condiciones y componentes IP exactos como la inmunoprecipitación real para eliminar cualquier constituyente celular no específico sin capturar la proteína diana (a menos, por supuesto, que la proteína diana se una de manera no específica a alguna otra Componente IP, que debe controlarse adecuadamente mediante el análisis de las perlas desechadas utilizadas para limpiar previamente el lisado). A continuación, la proteína diana se puede inmunoprecipitar con el riesgo reducido de que la unión no específica interfiera con la interpretación de los datos.
Cuentas superparamagnéticas
Si bien la gran mayoría de las inmunoprecipitaciones se realizan con perlas de agarosa, el uso de perlas superparamagnéticas para la inmunoprecipitación es un enfoque más nuevo que está ganando popularidad como alternativa a las perlas de agarosa para aplicaciones IP. A diferencia de la agarosa, las perlas magnéticas son sólidas y pueden ser esféricas, según el tipo de perla, y la unión del anticuerpo se limita a la superficie de cada perla. Si bien estas perlas no tienen la ventaja de un centro poroso para aumentar la capacidad de unión, las perlas magnéticas son significativamente más pequeñas que las perlas de agarosa (1 a 4 μm), y el mayor número de perlas magnéticas por volumen que las perlas de agarosa da colectivamente a las perlas magnéticas un efecto eficaz. relación superficie-volumen para una unión óptima de anticuerpos.
Las perlas magnéticas disponibles comercialmente se pueden separar basándose en la uniformidad de tamaño en perlas monodispersas y polidispersas . Las perlas monodispersas, también llamadas microperlas , exhiben una uniformidad exacta y, por lo tanto, todas las perlas exhiben características físicas idénticas, incluida la capacidad de unión y el nivel de atracción a los imanes. Las perlas polidispersas, si bien son de tamaño similar a las perlas monodispersas, muestran una amplia gama de variabilidad de tamaño (1 a 4 μm) que puede influir en su capacidad de unión y captura magnética. Aunque ambos tipos de perlas están disponibles comercialmente para aplicaciones de inmunoprecipitación, las perlas superparamagnéticas monodispersas de mayor calidad son más ideales para protocolos automáticos debido a su tamaño, forma y rendimiento consistentes. Muchas empresas, incluidas Invitrogen , Thermo Scientific y Millipore , ofrecen perlas superparamagnéticas monodispersas y polidispersas .
Agarosa vs perlas magnéticas
Los defensores de las perlas magnéticas afirman que las perlas exhiben una tasa más rápida de unión a proteínas [6] [7] [8] que las perlas de agarosa para aplicaciones de inmunoprecipitación, aunque las inmunoprecipitaciones estándar basadas en perlas de agarosa se han realizado en 1 hora. [4] También se ha afirmado que las perlas magnéticas son mejores para inmunoprecipitar complejos de proteínas extremadamente grandes debido a la falta total de un límite de tamaño superior para dichos complejos, [6] [7] [9] aunque no hay evidencia imparcial que lo indique. afirmar. La naturaleza de la tecnología de perlas magnéticas da como resultado una menor manipulación de muestras [7] debido a la reducción del estrés físico en las muestras de separación magnética frente a la centrifugación repetida cuando se usa agarosa, que puede contribuir en gran medida a aumentar el rendimiento de complejos proteicos lábiles (frágiles). [7] [8] [9] Sin embargo, en la selección de un soporte de inmunoprecipitación se deben considerar factores adicionales, como la capacidad de unión, el costo del reactivo, el requisito de equipo adicional y la capacidad para automatizar los procesos de IP.
Capacidad de encuadernación
Los defensores de las perlas de agarosa y magnéticas pueden argumentar si la gran diferencia en las capacidades de unión de las dos perlas favorece un tipo particular de perlas. En una comparación entre perlas, las perlas de agarosa tienen un área de superficie significativamente mayor y, por lo tanto, una mayor capacidad de unión que las perlas magnéticas debido al gran tamaño de las perlas y la estructura similar a una esponja. Pero el tamaño de poro variable de la agarosa causa un límite de tamaño superior potencial que puede afectar la unión de proteínas o complejos de proteínas extremadamente grandes a sitios de unión internos y, por lo tanto, las perlas magnéticas pueden ser más adecuadas para inmunoprecipitar proteínas o complejos de proteínas grandes que las perlas de agarosa. aunque hay una falta de evidencia comparativa independiente que pruebe ambos casos.
Algunos argumentan que la capacidad de unión significativamente mayor de las perlas de agarosa puede ser una desventaja debido a la mayor capacidad de unión no específica. Otros pueden abogar por el uso de perlas magnéticas debido a la mayor cantidad de anticuerpo necesaria para saturar la capacidad de unión total de las perlas de agarosa, lo que obviamente sería una desventaja económica del uso de agarosa. Si bien estos argumentos son correctos fuera del contexto de su uso práctico, estas líneas de razonamiento ignoran dos aspectos clave del principio de inmunoprecipitación que demuestra que la decisión de usar agarosa o perlas magnéticas no está simplemente determinada por la capacidad de unión.
Primero, la unión no específica no se limita a los sitios de unión del anticuerpo en el soporte inmovilizado; cualquier superficie del anticuerpo o componente de la reacción de inmunoprecipitación puede unirse a constituyentes de lisado inespecíficos y, por lo tanto, se producirá una unión inespecífica incluso cuando se utilicen perlas completamente saturadas. Por eso es importante aclarar previamente la muestra antes de realizar la inmunoprecipitación.
En segundo lugar, la capacidad para capturar la proteína diana depende directamente de la cantidad de anticuerpo inmovilizado utilizado y, por lo tanto, en una comparación lado a lado de la inmunoprecipitación de agarosa y perlas magnéticas, la mayor cantidad de proteína que cualquiera de los soportes puede capturar está limitada por el cantidad de anticuerpo añadido. Entonces, la decisión de saturar cualquier tipo de soporte depende de la cantidad de proteína requerida, como se describió anteriormente en la sección Agarosa de esta página.
Costo
El precio de usar cualquier tipo de soporte es un factor determinante clave en el uso de agarosa o perlas magnéticas para aplicaciones de inmunoprecipitación. Un cálculo típico a primera vista sobre el costo de las perlas magnéticas en comparación con las perlas de sefarosa puede hacer que las perlas de sefarosa parezcan menos costosas. Pero las perlas magnéticas pueden tener un precio competitivo en comparación con la agarosa para inmunoprecipitaciones a escala analítica, según el método IP utilizado y el volumen de perlas requerido por reacción IP.
Usando el método tradicional de inmunoprecipitación por lotes como se enumera a continuación, donde todos los componentes se agregan a un tubo durante la reacción de IP, las características de manejo físico de las perlas de agarosa requieren una cantidad mínima de perlas para cada experimento de IP (generalmente en el rango de 25 a 50 μl perlas por IP). Esto se debe a que las perlas de sefarosa deben concentrarse en el fondo del tubo mediante centrifugación y el sobrenadante debe eliminarse después de cada incubación, lavado, etc. Esto impone limitaciones físicas absolutas al proceso, ya que los sedimentos de perlas de agarosa de menos de 25 a 50 μl son difíciles si no imposible de identificar visualmente en la parte inferior del tubo. Con las perlas magnéticas, no se requiere una cantidad mínima de perlas debido a la manipulación magnética y, por lo tanto, dependiendo del antígeno diana y del anticuerpo IP, es posible utilizar considerablemente menos perlas magnéticas.
Por el contrario, se pueden emplear columnas de centrifugación en lugar de los tubos de microcentrífuga normales para reducir significativamente la cantidad de perlas de agarosa necesarias por reacción. Las columnas de centrifugado contienen un filtro que permite que todos los componentes de IP, excepto las perlas, fluyan mediante una centrifugación breve y, por lo tanto, proporcionan un método para usar significativamente menos perlas de agarosa con una pérdida mínima.
Equipo
Como se mencionó anteriormente, solo se requiere equipo de laboratorio estándar para el uso de perlas de agarosa en aplicaciones de inmunoprecipitación, mientras que se requieren imanes de alta potencia para reacciones IP basadas en perlas magnéticas. Si bien el equipo de captura magnética puede tener un costo prohibitivo, la rápida finalización de las inmunoprecipitaciones con perlas magnéticas puede ser un enfoque económicamente beneficioso cuando se deben otorgar las subvenciones, ya que un protocolo de 30 minutos con perlas magnéticas en comparación con la incubación durante la noche a 4 ° C con perlas de agarosa puede resultar en más datos generados en un período de tiempo más corto. [6] [7] [8]
Automatización
Un beneficio adicional del uso de perlas magnéticas es que los dispositivos de inmunoprecipitación automatizados están cada vez más disponibles. Estos dispositivos no solo reducen la cantidad de trabajo y el tiempo para realizar una IP, sino que también pueden usarse para aplicaciones de alto rendimiento .
Resumen
Si bien los claros beneficios del uso de perlas magnéticas incluyen una mayor velocidad de reacción, un manejo más suave de la muestra y el potencial de automatización, la elección de usar agarosa o perlas magnéticas según la capacidad de unión del medio de soporte y el costo del producto puede depender de la proteína de interés y el método IP utilizado. Al igual que con todos los ensayos, se requieren pruebas empíricas para determinar qué método es óptimo para una aplicación determinada.
Protocolo
Fondo
Una vez que se ha elegido la tecnología de perlas de sustrato sólido, los anticuerpos se acoplan a las perlas y las perlas recubiertas de anticuerpo se pueden añadir a la muestra de proteína heterogénea (por ejemplo, tejido homogeneizado). En este punto, los anticuerpos que están inmovilizados en las perlas se unirán a las proteínas que reconocen específicamente. Una vez que esto ha ocurrido, la porción de inmunoprecipitación del protocolo está realmente completa, ya que las proteínas específicas de interés se unen a los anticuerpos que están ellos mismos inmovilizados a las perlas. La separación de los inmunocomplejos del lisado es una serie de pasos extremadamente importante, porque las proteínas deben permanecer unidas entre sí (en el caso de co-IP) y unidas al anticuerpo durante los pasos de lavado para eliminar los no unidos. proteínas y reducir el fondo.
Cuando se trabaja con perlas de agarosa, las perlas deben sedimentarse de la muestra girando brevemente en una centrífuga con fuerzas entre 600 y 3000 xg (veces la fuerza gravitacional estándar). Este paso se puede realizar en un tubo de microcentrífuga estándar, pero para una separación más rápida, una mayor consistencia y mayores recuperaciones, el proceso a menudo se realiza en pequeñas columnas de centrifugación con un tamaño de poro que permite el paso de líquido, pero no de perlas de agarosa. Después de la centrifugación, las perlas de agarosa formarán un sedimento esponjoso muy suelto en el fondo del tubo. El sobrenadante que contiene contaminantes se puede eliminar con cuidado para no alterar las perlas. A continuación, se puede añadir el tampón de lavado a las perlas y, después de mezclar, las perlas se separan de nuevo mediante centrifugación.
Con perlas superparamagnéticas, la muestra se coloca en un campo magnético para que las perlas se puedan acumular en el costado del tubo. Este procedimiento generalmente se completa en aproximadamente 30 segundos y el líquido restante (no deseado) se elimina con una pipeta. Los lavados se logran resuspendiendo las perlas (fuera del imán) con la solución de lavado y luego concentrando las perlas en la pared del tubo (colocando el tubo nuevamente en el imán). El lavado se repite generalmente varias veces para asegurar la eliminación adecuada de contaminantes. Si las perlas superparamagnéticas son de tamaño homogéneo y el imán se ha diseñado correctamente, las perlas se concentrarán uniformemente en el costado del tubo y la solución de lavado se puede quitar fácil y completamente.
Después del lavado, la (s) proteína (s) precipitadas se eluyen y analizan mediante electroforesis en gel , espectrometría de masas , transferencia Western o cualquier otro método para identificar los constituyentes en el complejo. Los tiempos de protocolo para la inmunoprecipitación varían mucho debido a una variedad de factores, y los tiempos de protocolo aumentan con el número de lavados necesarios o con la cinética de reacción más lenta de las perlas de agarosa porosas.
Pasos
- Lyse las células y prepare la muestra para la inmunoprecipitación.
- Aclare previamente la muestra pasando la muestra sobre perlas solas o unida a un anticuerpo irrelevante para absorber las proteínas que se unan de manera no específica a los componentes IP.
- Incubar la solución con el anticuerpo contra la proteína de interés. El anticuerpo se puede unir al soporte sólido antes de este paso (método directo) o después de este paso (método indirecto). Continúe la incubación para permitir que se formen complejos anticuerpo-antígeno.
- Precipite el complejo de interés, retirándolo de la solución a granel.
- Lavar el complejo precipitado varias veces. Gire cada vez entre lavados cuando use perlas de agarosa o coloque el tubo en el imán cuando use perlas superparamagnéticas y luego retire el sobrenadante. Después del lavado final, elimine tanto sobrenadante como sea posible.
- Eluir proteínas del soporte sólido usando tampón de carga de muestra de pH bajo o SDS.
- Analizar complejos o antígenos de interés. Esto puede hacerse de varias maneras:
- SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida - dodecilsulfato de sodio ) seguido de tinción en gel.
- SDS-PAGE seguido de: tinción en gel, corte de bandas de proteínas teñidas individuales y secuenciación de las proteínas en las bandas mediante espectrometría de masas de desorción / ionización láser asistida por matriz (MALDI) .
- Transferencia y Western Blot usando otro anticuerpo para proteínas que interactuaban con el antígeno, seguido de detección usando un anticuerpo secundario quimioluminiscente o fluorescente .
Referencias
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enlaces externos
- Análisis de proteínas mediante inmunoprecipitación en ufl.edu
- Inmunoprecipitación en los encabezados de temas médicos (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU .
- Cromatina + inmunoprecipitación en los encabezados de temas médicos (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU .
- Introducción a la metodología de inmunoprecipitación