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Rotavirus

Una prueba de ácido nucleico ( NAT ) es una técnica que se utiliza para detectar una secuencia de ácido nucleico en particular y, por lo tanto, generalmente para detectar e identificar una especie o subespecie particular de organismo, a menudo un virus o una bacteria que actúa como patógeno en la sangre , los tejidos , la orina , etc. Los NAT se diferencian de otras pruebas en que detectan materiales genéticos ( ARN o ADN ) en lugar de antígenos o anticuerpos.. La detección de material genético permite un diagnóstico temprano de una enfermedad porque la detección de antígenos y / o anticuerpos requiere tiempo para que comiencen a aparecer en el torrente sanguíneo. [1] Dado que la cantidad de cierto material genético suele ser muy pequeña, muchas NAT incluyen un paso que amplifica el material genético, es decir, hace muchas copias de él. Estos NAT se denominan pruebas de amplificación de ácido nucleico ( NAAT ). Hay varias formas de amplificación, incluida la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), el ensayo de desplazamiento de cadena (SDA) o el ensayo mediado por transcripción (TMA). [2]

Prácticamente todos los métodos de amplificación de ácidos nucleicos y tecnologías de detección utilizan la especificidad del emparejamiento de bases Watson-Crick ; Sonda monocatenaria o moléculas cebadoras que capturan moléculas diana de ADN o ARN de cadenas complementarias . Por tanto, el diseño de las hebras de la sonda es muy importante para aumentar la sensibilidad y la especificidad de la detección. Sin embargo, los mutantes que forman la base genética de una variedad de enfermedades humanas suelen ser ligeramente diferentes de los ácidos nucleicos normales. A menudo, solo son diferentes en una sola base, por ejemplo, inserciones , eliminaciones ypolimorfismos de un solo nucleótido (SNP). En este caso, la unión imperfecta sonda-diana puede ocurrir fácilmente, dando como resultado resultados falsos positivos como confundir una cepa que es comensal con una que es patógena. Se ha dedicado mucha investigación a lograr la especificidad de una sola base.

Avances [ editar ]

Las hebras de ácido nucleico (ADN y ARN) con las secuencias correspondientes se unen en cadenas de pares, cerrándose como velcro en una secadora de ropa. Pero cada nodo de la cadena no es muy pegajoso, por lo que la cadena de doble hebra continuamente se abre parcialmente y se vuelve a cerrar bajo la influencia de las vibraciones ambientales (lo que se conoce como ruido térmico o movimiento browniano). Los emparejamientos más largos son más estables. Las pruebas de ácido nucleico utilizan una "sonda" que es una hebra larga con una hebra corta adherida. La cadena larga del cebador tiene una secuencia correspondiente (complementaria) a una cadena "diana" del organismo de la enfermedad que se está detectando. La hebra de la enfermedad se adhiere firmemente a la parte expuesta de la hebra larga del cebador (llamada "apoyo") y luego, poco a poco, desplaza la hebra corta "protectora" de la sonda.Al final, la hebra protectora corta no se une a nada y el cebador corto no unido es detectable. El resto de esta sección ofrece algo de historia de la investigación necesaria para ajustar este proceso y convertirlo en una prueba útil.

En 2012, el grupo de investigación de Yin publicó un artículo sobre la optimización de la especificidad de la hibridación de ácidos nucleicos. [3]Introdujeron una 'sonda de intercambio de dedos (PC)' que consiste en una hebra de complemento C prehibridada y una hebra protectora P. La hebra de complemento es más larga que la hebra protectora y tiene una cola suelta en el extremo, un dedo del pie. El complemento es perfectamente complementario con la secuencia objetivo. Cuando la diana correcta (X) reacciona con la sonda de intercambio del pie (PC), se libera P y se forma el producto XC hibridado. La energía libre estándar (∆) de la reacción es cercana a cero. Por otro lado, si la sonda de intercambio del pie (PC) reacciona con el objetivo espurio (S), la reacción avanza, pero la energía libre estándar aumenta para ser menos favorable termodinámicamente. La diferencia estándar de energía libre (∆∆) es lo suficientemente significativa como para dar una discriminación obvia en el rendimiento. El factor de discriminación Q se calcula como,el rendimiento de la hibridación diana correcta dividido por el rendimiento de la hibridación diana falsa. A través de los experimentos en diferentes sondas de intercambio de puntos con 5 objetivos correctos y 55 objetivos espurios con cambios de base única energéticamente representativos (reemplazos, deleciones e inserciones), el grupo de Yin concluyó que los factores de discriminación de estas sondas estaban entre 3 y 100 + con la mediana 26. Las sondas funcionan robustamente de 10 ° C a 37 ° C, de 1 mM a 47 mM, y con concentraciones de ácido nucleico de 1 nM a 5 M. También descubrieron que las sondas de intercambio de puntas funcionan de manera robusta incluso en la detección de ARN.deleciones e inserciones), el grupo de Yin concluyó que los factores de discriminación de estas sondas estaban entre 3 y 100 + con una mediana de 26. Las sondas funcionan de manera robusta de 10 ° C a 37 ° C, de 1 mM a 47 mM y con ácido nucleico concentraciones de 1 nM a 5 M. También descubrieron que las sondas de intercambio del pie funcionan de manera robusta incluso en la detección de ARN.deleciones e inserciones), el grupo de Yin concluyó que los factores de discriminación de estas sondas estaban entre 3 y 100 + con una mediana de 26. Las sondas funcionan de manera robusta de 10 ° C a 37 ° C, de 1 mM a 47 mM y con ácido nucleico concentraciones de 1 nM a 5 M. También descubrieron que las sondas de intercambio del pie funcionan de manera robusta incluso en la detección de ARN.

A partir de entonces, se han estudiado más investigaciones. En 2013, el grupo de Seelig publicó un artículo sobre sondas moleculares fluorescentes que también utiliza la reacción de intercambio del pie. [4] Esto permitió la detección óptica del objetivo correcto y del objetivo SNP. También tuvieron éxito en la detección de SNP en muestras derivadas de E. coli.

En 2015, el grupo de David logró una selectividad extremadamente alta (más de 1000) de variantes de un solo nucleótido (SNV) al introducir el sistema llamado 'composiciones competitivas'. [5] En este sistema, construyeron un modelo de reacción cinética de los procesos de hibridación subyacentes para predecir los valores óptimos de los parámetros, que varían según las secuencias de SNV y wildtype (WT), en la arquitectura de diseño de la sonda y el sumidero, y en el reactivo. concentraciones y condiciones de ensayo. Su modelo tuvo éxito en una selectividad mediana de 890 campos para 44 SNV de ADN relacionados con el cáncer, con un mínimo de 200, lo que representa una mejora de al menos 30 veces con respecto a los ensayos anteriores basados ​​en hibridación. Además, aplicaron esta tecnología para analizar secuencias de VAF bajas a partir de ADN genómico humano después de la PCR, así como directamente a secuencias de ARN sintéticas.

Basándose en la experiencia, desarrollaron un nuevo método de PCR llamado Amplificación por desplazamiento de bloqueadores (BDA). [6]Es una PCR resistente a la temperatura que amplifica selectivamente todas las variantes de secuencia dentro de una ventana de aproximadamente 20 nt por 1000 veces sobre las secuencias de tipo salvaje, lo que permite una fácil detección y cuantificación de cientos de variantes de potenciales originalmente a una frecuencia de alelos ≤ 0,1%. BDA logra un rendimiento de enriquecimiento similar en temperaturas de recocido que oscilan entre 56 ° C y 64 ° C. Esta resistencia a la temperatura facilita el enriquecimiento multiplexado de muchas variantes diferentes en el genoma y, además, permite el uso de instrumentos de termociclado portátiles y económicos para la detección de variantes raras de ADN. La BDA se ha validado incluso en tipos de muestras, incluidas muestras clínicas de ADN sin células extraídas del plasma sanguíneo de pacientes con cáncer de pulmón.

Aplicaciones [ editar ]

  • Diagnóstico de infecciones gonocócicas y otras infecciones por Neisseria: amplificación de secuencias de ADN o ARN específicas de N. gonorrhea para su detección. [7]
  • Diagnóstico de infecciones urogenitales por C. trachomatis [8]
  • Detección de Mycobacterium tuberculosis [9]
  • Detección de ARN o ADN del VIH [10]
  • Detección de coronavirus zoonóticos [11]

Referencias [ editar ]

  1. ^ "¿Qué es la prueba de ácido nucleico (NAT)?" . Cruz Roja Americana.
  2. ^ Peter A. Leone, Joseph A. Duncan (2011). Enfermedades infecciosas tropicales: principios, patógenos y práctica (tercera edición) . Filadelfia: Elsevier. págs. 184-190.
  3. ^ Peng Yin, David Zhang (2012). "Optimización de la especificidad de la hibridación de ácidos nucleicos" . Química de la naturaleza . 4 (3): 208–214. Código Bibliográfico : 2012NatCh ... 4..208Z . doi : 10.1038 / NCHEM.1246 . PMC 4238961 . PMID 22354435 .  
  4. ^ Georg Seelig, Sherry Chen (2013). "Sondas moleculares condicionalmente fluorescentes para detectar cambios de una sola base en el ADN de doble hebra" . Química de la naturaleza . 5 (9): 782–789. Código bibliográfico : 2013NatCh ... 5..782C . doi : 10.1038 / NCHEM.1713 . PMC 3844531 . PMID 23965681 .  
  5. ^ David Zhang, Juexiao Sherry Wang (2015). "Diseño de sonda de ADN guiado por simulación para una hibridación ultraespecífica constante" . Química de la naturaleza . 7 (7): 545–553. Código Bibliográfico : 2015NatCh ... 7..545W . doi : 10.1038 / NCHEM.2266 . PMC 4479422 . PMID 26100802 .  
  6. ^ David Zhang, Lucia R. Wu (2017). "Enriquecimiento multiplexado de variantes raras de ADN mediante amplificación de secuencia selectiva y resistente a la temperatura" . Ingeniería Biomédica de la Naturaleza . 1 (9): 714–723. doi : 10.1038 / s41551-017-0126-5 . PMC 5969535 . PMID 29805844 .  
  7. ^ Peter A. Leone, Joseph A. Duncan (2011). Enfermedades infecciosas tropicales: principios, patógenos y práctica (tercera edición) . Filadelfia: Elsevier. págs. 184-190.
  8. ^ Fan, Huizhou (2015). Microbiología médica molecular (segunda edición) . Prensa académica. págs. 1449-1469.
  9. ^ Ridderhof, John C (2009). Tuberculosis . Elsevier. págs. 738–745.
  10. ^ Gillespie, Susan L. (2013). Inmunología clínica (cuarta edición) . Elsevier. págs. 465–479.
  11. ^ Schmidt, Michael; Brixner, Veronika; Ruster, Brigitte; Hourfar, Michael K .; Drosten, Christian ; Preiser, Wolfgang; Seifried, Erhard; Roth, W. Kurt (abril de 2004). "El cribado NAT de donantes de sangre para el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo puede prevenir potencialmente las transmisiones asociadas a la transfusión" . Transfusión . 44 (4): 470–475. doi : 10.1111 / j.1537-2995.2004.03269.x . ISSN 0041-1132 . PMID 15043560 .