Los elementos P son elementos transponibles que se descubrieron en Drosophila como agentes causantes de rasgos genéticos llamados disgenesia híbrida . El transposón es responsable de la P rasgo de la P elemento y se encuentra sólo en moscas silvestres. También se encuentran en muchos otros eucariotas. [1]
El elemento P codifica la proteína P transposasa. A diferencia de las hembras de cepas de laboratorio, se cree que las hembras de tipo salvaje también expresan un inhibidor de la función P transposasa, a partir del mismo elemento. Este inhibidor reduce la alteración del genoma causada por los elementos P , lo que permite una progenie fértil. La evidencia de esto proviene de cruces de hembras de laboratorio (que carecen del inhibidor de la transposasa P ) con machos de tipo salvaje (que tienen elementos P ). En ausencia del inhibidor, los elementos P pueden proliferar por todo el genoma, alterando muchos genes y matando a la progenie.
Los elementos P se utilizan comúnmente como agentes mutagénicos en experimentos genéticos con Drosophila. Una ventaja de este enfoque es que las mutaciones son fáciles de localizar. En la disgenesia híbrida, una cepa de Drosophila se aparea con otra cepa de Drosophila produciendo descendencia híbrida y causando daño cromosómico conocido por ser disgénico. La disgenesia híbrida requiere la contribución de ambos padres. Por ejemplo, en el sistema PM , donde la cepa P contribuye paternalmente y la cepa M contribuye maternalmente, puede ocurrir disgenesia. La cruz inversa, con M padre citotipo y P madre, produce descendencia normal, ya que cruza en un P x P o M x M manera. Los cromosomas masculinos P pueden causar disgenesia cuando se cruzan con una hembra M.
Caracteristicas
El elemento P es un transposón de clase II y se mueve mediante un mecanismo de "cortar y pegar" basado en el ADN. La secuencia comprende 4 exones con 3 intrones . [2] El empalme completo de los intrones produce la enzima transposasa, mientras que el empalme parcial alternativo del intrón 1 y 2 dejando solo el intrón 3 codifica el represor del elemento P. El elemento P autónomo completo codifica una enzima transposasa , que reconoce las repeticiones invertidas terminales de 31 pb del elemento P y cataliza la escisión y reinserción del elemento P. El elemento completo es 2907 pb; Los elementos P no autónomos contienen una deleción interna de longitud variable que anula la producción de transposasa, pero estos elementos aún pueden movilizarse si la transposasa está codificada en otra parte del genoma . La inserción del elemento P y la posterior escisión dan como resultado la producción de repeticiones directas de 8 pb, y la presencia de tales repeticiones es indicativa de la actividad previa del elemento P.
Todos los elementos P tienen una estructura canónica que contiene repeticiones invertidas terminales de 31 pb y repeticiones invertidas internas de 11 pb ubicadas en el dominio THAP de la transposasa . Los elementos P más cortos y más largos son elementos no autónomos. Los elementos P más largos codifican la transposasa necesaria para la transposición. El elemento P también codifica un supresor de la transposición, que se acumula en el citoplasma durante el desarrollo de las células. Por lo tanto, en un cruce de un macho P o M con una hembra P, el citoplasma femenino contiene el supresor, que se une a cualquier elemento P e impide su transposición.
Disgenesia híbrida
Disgenesia híbrido se refiere a la alta tasa de mutación en la línea germinal células de Drosophila cepas resultantes de un cruce de machos con autónomas P elementos ( P Strain / P citotipo) y mujeres que carecen de P elementos ( M Strain / M citotipo). El síndrome de disgenesia híbrida se caracteriza por esterilidad dependiente de la temperatura, tasas elevadas de mutación y aumento del reordenamiento y recombinación cromosómica.
El fenotipo de disgenesia híbrida se ve afectado por la transposición de elementos P dentro de las células de la línea germinal de la descendencia de machos de la cepa P con hembras de la cepa M. La transposición solo ocurre en las células de la línea germinal, porque un evento de corte y empalme necesario para producir ARNm de transposasa no ocurre en las células somáticas.
La disgenesia híbrida se manifiesta cuando se cruzan machos de la cepa P con hembras de la cepa M y no cuando se cruzan hembras de la cepa P (hembras con elementos P autónomos ) con machos de la cepa M. Los huevos de las hembras de la cepa P contienen altas cantidades de una proteína represora que previene la transcripción del gen de la transposasa. Los óvulos de las madres de la cepa M , que no contienen la proteína represora, permiten la transposición de los elementos P del esperma de los padres. En las hembras de la cepa P , los represores se encuentran en el citoplasma. Por lo tanto, cuando los machos de la cepa P fertilizan a las hembras de la cepa M (cuyo citoplasma no contiene represor), el macho aporta su genoma con el elemento P pero no el citoplasma masculino que conduce a la progenie de la cepa P. [2]
Este efecto contribuye a que los piRNA se hereden solo en la línea materna, lo que proporciona un mecanismo de defensa contra los elementos P. [3]
Uso en biología molecular
El elemento P ha encontrado un amplio uso en la investigación de Drosophila como mutágeno. El sistema de mutagénesis utiliza típicamente un elemento autónomo pero inmóvil y un elemento no autónomo móvil. Las moscas de generaciones posteriores se pueden cribar mediante fenotipo o PCR . Los elementos P de origen natural contienen una secuencia codificante para la enzima transposasa y secuencias de reconocimiento para la acción de la transposasa. La transposasa regula y cataliza la escisión de un elemento P del ADN del huésped, cortando en los dos sitios de reconocimiento y luego reinsertándolo al azar. Es la inserción aleatoria la que puede interferir con los genes existentes, o llevar un gen adicional, que puede usarse para la investigación genética.
Para utilizar esto como una herramienta genética útil y controlable, las dos partes del elemento P deben estar separadas para evitar la transposición incontrolada. Las herramientas genéticas normales son el ADN que codifica la transposasa sin secuencias de reconocimiento de transposasa, por lo que no se puede insertar y un " Plásmido P ". Los plásmidos P siempre contienen un gen indicador de Drosophila , a menudo un marcador de ojos rojos (producto del gen blanco ) y secuencias de reconocimiento de transposasa. Pueden contener un gen de interés, un gen marcador seleccionable de E. coli , a menudo algún tipo de resistencia a los antibióticos , un origen de replicación u otras secuencias de "mantenimiento" del plásmido asociadas .
Métodos de uso
Hay dos formas principales de utilizar estas herramientas:
Transformación de moscas
- Clone el elemento P en un plásmido y transforme y cultive esto en bacterias.
- Elimine la transposasa P y reemplácela con su gen de interés.
- Microinyecte el extremo posterior de un embrión en etapa temprana (precelularización) con ADN que codifica la transposasa y un plásmido con el gen informador, el gen de interés y las secuencias de reconocimiento de la transposasa.
- Se produce una transposición aleatoria que inserta el gen de interés y el gen informador.
- Una vez que se ha insertado el gen de interés, ya no es móvil porque no puede producir su propia P transposasa.
- Cultiva moscas y cruza para eliminar la variación genética entre las células del organismo. (Solo algunas de las células del organismo se habrán transformado. Con suerte, algunas de estas células transformadas terminan en la línea germinal. Un gameto transformado dará lugar a un organismo sin variación entre sus células).
- Busque moscas que expresen el gen reportero. Estos portan el gen de interés insertado, por lo que pueden investigarse para determinar el fenotipo debido al gen de interés.
El gen insertado puede haber dañado la función de uno de los genes del huésped. Se requieren varias líneas de moscas para que se pueda realizar la comparación y garantizar que no se hayan eliminado genes adicionales.
Mutagénesis insercional
- Microinyectar el embrión con ADN que codifica la transposasa y un plásmido con el gen indicador y las secuencias de reconocimiento de la transposasa (y a menudo el gen indicador de E. coli y el origen de replicación, etc.).
- Se produce una transposición aleatoria, insertando el gen informador de forma aleatoria. La inserción tiende a ocurrir cerca de genes transcritos activamente, ya que aquí es donde la estructura de la cromatina es más suelta, por lo que el ADN es más accesible.
- Cultiva moscas y cruza para eliminar la variación genética entre las células del organismo (ver arriba).
- Busque moscas que expresen el gen reportero. Estos han experimentado una transposición exitosa, por lo que pueden investigarse para determinar el fenotipo debido a la mutación de genes existentes.
Posibles mutaciones:
- Inserción en una región traducida => proteína híbrida / proteína truncada. Suele provocar pérdida de la función proteica, aunque se observan efectos más complejos.
- Inserción en un intrón => patrón de empalme alterado / falla de empalme. Por lo general, da como resultado el truncamiento de proteínas o la producción de productos inactivos mal empalmados, aunque son comunes los efectos más complejos.
- Inserción en 5 '(la secuencia que se convertirá en el ARNm 5' UTR) región no traducida => truncamiento de la transcripción. Por lo general, da como resultado que el ARNm no contenga un límite 5 ' , lo que conduce a una traducción menos eficiente.
- Inserción en promotor => reducción / pérdida completa de expresión. Siempre resulta en niveles de producción de proteínas muy reducidos. El tipo de inserción más útil para el análisis por la sencillez de la situación.
- Inserción entre el promotor y los potenciadores ascendentes => pérdida de la función potenciadora / secuestro de la función potenciadora del gen indicador. † Generalmente reduce el nivel de especificidad de la proteína para el tipo de célula, aunque a menudo se observan efectos complejos.
Atrapamiento potenciador
El secuestro de un potenciador de otro gen permite el análisis de la función de ese potenciador. Esto, especialmente si el gen reportero es para una proteína fluorescente, puede usarse para ayudar a mapear la expresión del gen mutado a través del organismo y es una herramienta muy poderosa. Es una herramienta útil para observar patrones de expresión genética (temporal y espacialmente).
Otro uso
Estos métodos se conocen como genética inversa. La genética inversa es un enfoque para descubrir la función de un gen mediante el análisis de los efectos fenotípicos de secuencias de genes específicas obtenidas mediante secuenciación de ADN.
Análisis de productos de mutagénesis
Una vez que se ha determinado la función de la proteína mutada, es posible secuenciar / purificar / clonar las regiones que flanquean la inserción mediante los siguientes métodos:
PCR inversa
- Aislar el genoma de la mosca.
- Someterse a una digestión ligera (usando una enzima [enzima 1] que se sabe que NO corta el gen reportero), dando fragmentos de unas pocas kilobases, algunas con la inserción y su ADN flanqueante.
- Autoliga la digestión (baja concentración de ADN para asegurar la autoligación) dando una selección de fragmentos circulares de ADN, algunos con la inserción y su ADN flanqueante.
- Cortar los plásmidos en algún punto del gen informador (con una enzima [enzima 2] que se sabe que corta muy raramente en el ADN genómico, pero que se sabe que en el gen informador).
- Utilizando cebadores para las secciones del gen indicador, el ADN se puede amplificar para secuenciar .
El proceso de corte, autoligación y re-corte permite la amplificación de las regiones flanqueantes del ADN sin conocer la secuencia. El punto en el que se produjo la ligadura puede verse identificando el sitio de corte de la [enzima 1].
Rescate de plásmidos
- Aislar el genoma de la mosca.
- Someterse a una digestión ligera (utilizando una enzima [enzima 1] que se sabe que corta el límite entre el gen reporter y el gen reporter de E. coli y las secuencias de plásmido), dando fragmentos de unas pocas kilobases, algunas con el reporter de E. coli , las secuencias de plásmido y su ADN flanqueante.
- Autoliga la digestión (baja concentración de ADN para asegurar la autoligación) dando una selección de fragmentos de ADN circulares, algunos con el reportero de E. coli , las secuencias de plásmido y su ADN flanqueante.
- Inserte los plásmidos en células de E. coli (por ejemplo, mediante electroporación).
- Seleccione plásmidos para el gen marcador seleccionable de E. coli . Solo los insertos exitosos de plásmidos con las secuencias de "mantenimiento" del plásmido expresarán este gen.
- El gen se puede clonar para su posterior análisis.
Referencias
- Leland Hartwell et al .. 2004. Genética: de genes a genomas 2ª edición. McGraw-Hill
- Engels, elementos WR P en Drosophila
- ^ Majumdar, S; Rio, DC (abril de 2015). "P elementos transponibles en Drosophila y otros organismos eucariotas" . Espectro de microbiología . 3 (2): MDNA3–0004–2014. doi : 10.1128 / microbiolspec.MDNA3-0004-2014 . PMC 4399808 . PMID 26104714 .
- ^ a b Griffiths, AJ (2005). Introducción al análisis genético . Macmillan.
- ^ Brennecke, J .; et al. (2008). "Un papel epigenético para los piRNA heredados de la madre en el silenciamiento de transposones" . Ciencia . 322 (5906): 1387-1392. Código Bibliográfico : 2008Sci ... 322.1387B . doi : 10.1126 / science.1165171 . PMC 2805124 . PMID 19039138 .
enlaces externos
- FlyBase