La extracción ácida con tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo (abreviado AGPC ) es una técnica de extracción líquido-líquido en bioquímica . Se usa ampliamente en biología molecular para aislar ARN (así como ADN y proteínas en algunos casos). Este método puede llevar más tiempo que un sistema basado en columnas , como la purificación basada en sílice, pero tiene una mayor pureza y la ventaja de una alta recuperación de ARN: [1] una columna de ARN normalmente no es adecuada para la purificación de cortos (<200 nucleótidos ) Especies de ARN, como ARNip , miARN ,gRNA y tRNA .
Originalmente fue ideado por Piotr Chomczynski y Nicoletta Sacchi , quienes publicaron su protocolo en 1987. [2] [3] Sigma-Aldrich vende el reactivo con el nombre de reactivo TRI; por Invitrogen bajo el nombre TRIzol ; por Bioline como Trisure; y por Tel-Test como STAT-60.
Cómo funciona
Este método se basa en la separación de fases por centrifugación de una mezcla de la muestra acuosa y una solución que contiene fenol saturado de agua y cloroformo , lo que da como resultado una fase acuosa superior y una fase orgánica inferior (principalmente fenol). El tiocianato de guanidinio , un agente caotrópico , se agrega a la fase orgánica para ayudar en la desnaturalización de proteínas (como las que se unen fuertemente a los ácidos nucleicos o las que degradan el ARN). Los ácidos nucleicos (ARN y / o ADN) se dividen en la fase acuosa, mientras que las proteínas se dividen en la fase orgánica. El pH de la mezcla determina qué ácidos nucleicos se purifican. [4] En condiciones ácidas (pH 4-6), el ADN se divide en la fase orgánica mientras que el ARN permanece en la fase acuosa. En condiciones neutras (pH 7-8), tanto el ADN como el ARN se reparten en la fase acuosa. En un último paso, los ácidos nucleicos se recuperan de la fase acuosa mediante precipitación con 2-propanol . A continuación, se lava el 2-propanol con etanol y el sedimento se seca al aire brevemente y se disuelve en tampón TE o agua libre de ARNasa.
El tiocianato de guanidinio desnaturaliza las proteínas, incluidas las ARNasas, y separa el ARNr de las proteínas ribosomales, mientras que el fenol , el isopropanol y el agua son disolventes con escasa solubilidad. En presencia de cloroformo o BCP ( bromocloropropano ), estos disolventes se separan completamente en dos fases que se reconocen por su color: una fase acuosa superior transparente (que contiene los ácidos nucleicos) y una fase inferior (que contiene las proteínas disueltas en fenol y el lípidos disueltos en cloroformo). También se pueden utilizar otros productos químicos desnaturalizantes como el 2-mercaptoetanol y la sarcosina . El principal inconveniente es que el fenol y el cloroformo son materiales peligrosos e inconvenientes, y la extracción suele ser laboriosa, por lo que en los últimos años muchas empresas ofrecen ahora formas alternativas de aislar el ARN.
Reactivos
- Fenol : El fenol utilizado para la bioquímica viene como una solución saturada de agua con tampón Tris , como fenol al 50% tamponado con Tris , solución de cloroformo al 50% o como fenol al 50% tamponado con Tris, cloroformo al 48%, alcohol isoamílico al 2% solución (a veces llamada "25: 24: 1"). El fenol es naturalmente algo soluble en agua y da una interfaz difusa, que se agudiza por la presencia de cloroformo, y el alcohol isoamílico reduce la formación de espuma. La mayoría de las soluciones también tienen un antioxidante, ya que el fenol oxidado daña los ácidos nucleicos. Para la purificación de ARN, el pH se mantiene alrededor de 4, lo que retiene el ARN en la fase acuosa preferentemente. Para la purificación del ADN, el pH suele ser cercano a 7, momento en el que todos los ácidos nucleicos se encuentran en la fase acuosa.
- Cloroformo : El cloroformo se estabiliza con pequeñas cantidades de amileno o etanol , porque la exposición del cloroformo puro al oxígeno y la luz ultravioleta produce gas fosgeno . Algunas soluciones de cloroformo vienen como una mezcla de cloroformo al 96% y alcohol isoamílico al 4% que se puede mezclar con un volumen igual de fenol para obtener la solución 25: 24: 1.
- Alcohol isoamílico : el alcohol isoamílico puede reducir la formación de espuma y asegurar la desactivación de las RNasas.
Ver también
Referencias
- ^ Morrison; et al. (2003). "Comparación de AGPC con purificación de ácido nucleico en columna". Revista de tecnología biomolecular . 21 (17): 411–432.
- ^ Chomczynski, P .; Sacchi, N. (1987). "Método de un solo paso de aislamiento de ARN por extracción ácida de tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo". Anal. Biochem. 162 (1): 156-159. doi : 10.1016 / 0003-2697 (87) 90021-2 . PMID 2440339 .
- ^ Chomczynski, P .; Sacchi, N. (2006). "Método de un solo paso de aislamiento de ARN por extracción de ácido tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio: Veinte años después". Protocolos de la naturaleza . 1 (2): 581–585. doi : 10.1038 / nprot.2006.83 . PMID 17406285 . S2CID 28653075 .
- ^ Perry RP, La Torre J, Kelley DE, Greenberg JR. (1972) Sobre la labilidad de las secuencias de poli (A) durante la extracción de ARN mensajero de polirribosomas. Biochim. Biophys. Acta 262: 220-226; Brawerman G, Mendecki J, Lee SY. (1972) Un procedimiento para el aislamiento de ácido ribonucleico mensajero de mamíferos. Biochemistry 11: 637–641.
enlaces externos
- Manual para reactivo TRI
- Protocolo en OpenWetWare
- Invitrogen