Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa
La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa ( RT-PCR ) es una técnica de laboratorio que combina la transcripción inversa de ARN en ADN (en este contexto llamado ADN complementario o ADNc) y la amplificación de dianas de ADN específicas mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). [1] Se utiliza principalmente para medir la cantidad de un ARN específico. Esto se logra monitoreando la reacción de amplificación usando fluorescencia, una técnica llamada PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR). La RT-PCR y la qPCR combinadas se utilizan de forma rutinaria para el análisis de la expresión génica. y cuantificación del ARN viral en entornos clínicos y de investigación.
La estrecha asociación entre RT-PCR y qPCR ha llevado al uso metonímico del término qPCR para significar RT-PCR. Tal uso puede resultar confuso, [2] ya que la RT-PCR puede usarse sin qPCR, por ejemplo, para permitir la clonación molecular , secuenciación o detección simple de ARN. Por el contrario, la qPCR puede usarse sin RT-PCR, por ejemplo, para cuantificar el número de copias de un fragmento específico de ADN.
La técnica combinada de RT-PCR y qPCR se ha descrito como RT-PCR cuantitativa [3] o RT-PCR en tiempo real [4] (a veces incluso llamada RT-PCR cuantitativa en tiempo real [5] ), y se ha abreviado de diversas formas como qRT-PCR, [6] RT-qPCR, [7] RRT-PCR, [8] y rRT-PCR. [9] Para evitar confusiones, las siguientes abreviaturas se utilizarán de forma coherente a lo largo de este artículo:
No todos los autores, especialmente los anteriores, utilizan esta convención y el lector debe tener cuidado al seguir los enlaces. La RT-PCR se ha utilizado para indicar tanto la PCR en tiempo real (qPCR) como la PCR de transcripción inversa (RT-PCR).
Desde su introducción en 1977, la transferencia Northern se ha utilizado ampliamente para la cuantificación de ARN a pesar de sus deficiencias: (a) técnica que requiere mucho tiempo, (b) requiere una gran cantidad de ARN para la detección, y (c) cuantitativamente inexacta en la baja abundancia de Contenido de ARN. [10] [11] Sin embargo, desde su invención por Kary Mullis en 1983, la RT PCR ha desplazado a la transferencia Northern como el método de elección para la detección y cuantificación de ARN. [12]
La RT-PCR se ha convertido en la tecnología de referencia para la detección y / o comparación de los niveles de ARN por varias razones: (a) no requiere procesamiento posterior a la PCR, (b) una amplia gama (> 10 7 veces) de ARN la abundancia se puede medir y (c) proporciona información sobre datos tanto cualitativos como cuantitativos. [5] Debido a su simplicidad, especificidad y sensibilidad, la RT-PCR se utiliza en una amplia gama de aplicaciones, desde experimentos tan simples como la cuantificación de células de levadura en el vino hasta usos más complejos como herramientas de diagnóstico para detectar agentes infecciosos como la gripe aviar. virus y SARS-CoV-2 . [13] [14] [15]
