La mutagénesis por saturación de secuencias ( SeSaM ) es un método de mutagénesis aleatoria quimioenzimática aplicado para la evolución dirigida de proteínas y enzimas . [ cita requerida ] Es una de las técnicas de mutagénesis por saturación más comunes . En cuatro pasos de reacción basados en PCR , los nucleótidos de fosforotioato se insertan en la secuencia del gen , se escinden y los fragmentos resultantes se alargan mediante nucleótidos universales o degenerados.. Estos nucleótidos luego se reemplazan por nucleótidos estándar, lo que permite una amplia distribución de mutaciones de ácidos nucleicos repartidas en la secuencia del gen con preferencia a las transversiones y con un enfoque único en mutaciones puntuales consecutivas, ambas difíciles de generar mediante otras técnicas de mutagénesis. La técnica fue desarrollada por el profesor Ulrich Schwaneberg en la Universidad Jacobs de Bremen y la Universidad RWTH Aachen .
Tecnología, desarrollo y ventajas
SeSaM se ha desarrollado para superar varias de las principales limitaciones que se encuentran al trabajar con métodos de mutagénesis estándar basados en técnicas simples de PCR propensa a errores (epPCR). Estas técnicas de epPCR se basan en el uso de polimerasas y, por lo tanto, encuentran limitaciones que resultan principalmente de la circunstancia de que sólo se realizan sustituciones de ácido nucleico únicas, pero muy raramente consecutivas, y que estas sustituciones se producen normalmente sólo en posiciones favorecidas específicas. Además, las transversiones de ácidos nucleicos son mucho menos probables que las transiciones y requieren polimerasas diseñadas específicamente con un sesgo alterado . [1] Estas características de los intercambios de ácidos nucleicos catalizados por epPCR, junto con el hecho de que el código genético está degenerado, disminuyen la diversidad resultante en el nivel de aminoácidos . Las sustituciones sinónimas conducen a la conservación de aminoácidos o las mutaciones conservadoras con propiedades físico-químicas similares, como el tamaño y la hidrofobicidad, son muy prevalentes. [2] [3] Mediante la introducción no específica de bases universales en cada posición de la secuencia del gen, SeSaM supera el sesgo de la polimerasa que favorece las sustituciones transitorias en posiciones específicas, pero abre la secuencia completa del gen a un conjunto diverso de intercambios de aminoácidos. [4]
Durante el desarrollo del método SeSaM, se introdujeron varias modificaciones que permitieron la introducción de varias mutaciones simultáneamente. [5] Otro avance del método se logró mediante la introducción de bases degeneradas en lugar de la inosina universal y el uso de ADN polimerasas optimizadas, aumentando aún más la proporción de transversiones introducidas. [6] Este método SeSaM-TV + modificado además permite y favorece la introducción de dos intercambios de nucleótidos consecutivos, ampliando fuertemente el espectro de aminoácidos que pueden ser sustituidos.
Mediante varias optimizaciones, incluida la aplicación de una quimera polimerasa mejorada en el paso III del método SeSaM-TV-II [7] [8] y la adición de un nucleótido degenerado alternativo para la sustitución eficiente de las bases de timina y citosina y una mayor frecuencia de mutación en SeSaM -P / R, [9] las bibliotecas generadas se mejoraron aún más con respecto al número de transversión y el número de mutaciones consecutivas se elevó a 2-4 mutaciones consecutivas con una tasa de mutaciones consecutivas de hasta el 30%. [10]
Procedimiento
El método SeSaM consta de cuatro pasos basados en PCR que se pueden ejecutar en dos o tres días. Las partes principales incluyen la incorporación de nucleótidos de fosforotioato, la fragmentación química en estas posiciones, la introducción de bases universales o degeneradas y su reemplazo por nucleótidos naturales que insertan mutaciones puntuales.
Inicialmente, las secuencias "SeSaM" universales se insertan mediante PCR con cebadores específicos de genes que se unen delante y detrás del gen de interés. El gen de interés con sus regiones flanqueantes se amplifica para introducir estas secuencias SeSaM_fwd y SeSaM_rev y generar una plantilla para pasos consecutivos de PCR.
Estos llamados moldes fwd y rev moldes generados ahora se amplifican en una reacción de PCR con una mezcla predefinida de fosforotioato y nucleótidos estándar para asegurar una distribución uniforme de las mutaciones insertadas en toda la longitud del gen. Los productos de la PCR del Paso 1 se escinden específicamente en los enlaces de fosforotioato, generando un conjunto de fragmentos de ADN monocatenarios de diferentes longitudes a partir del cebador universal.
En el Paso 2 de SeSaM, las hebras simples de ADN se alargan de una a varias bases universales o degeneradas (dependiendo de la modificación de SeSaM aplicada) catalizadas por la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT). Este paso es el paso clave para introducir las mutaciones consecutivas características para mutar codones completos al azar.
Posteriormente, en el Paso 3 se realiza una PCR recombinando los fragmentos de ADN monocatenario con el correspondiente molde inverso de longitud completa, generando el gen bicatenario de longitud completa que incluye bases universales o degeneradas en su secuencia.
Mediante el reemplazo de las bases universales / degeneradas en la secuencia génica por nucleótidos estándar aleatorios en el Paso 4 de SeSaM, se genera una matriz diversa de secuencias génicas de longitud completa con mutaciones de sustitución, incluida una alta carga de transversiones y mutaciones de sustitución posteriores.
Aplicaciones
SeSaM se utiliza para optimizar directamente proteínas a nivel de aminoácidos, pero también para identificar preliminarmente posiciones de aminoácidos para probar en mutagénesis de saturación para el intercambio de aminoácidos ideal. SeSaM se ha aplicado con éxito en numerosas campañas de evolución dirigida de diferentes clases de enzimas para su mejora hacia propiedades seleccionadas como celulasa para resistencia a líquidos iónicos, [11] proteasa con mayor tolerancia a detergentes, [12] glucosa oxidasa para aplicación analítica, [13] fitasa con mayor termoestabilidad [14] y monooxigenasa con eficiencia catalítica mejorada utilizando donantes de electrones alternativos. [15] SeSaM está protegida por patente US770374 B2 en más de 13 países y es una de las tecnologías de plataforma de SeSaM-Biotech GmbH .
Referencias
- ^ Wong, TS; Zhurina, D .; Schwaneberg, U. (2006). "El desafío de la diversidad en la evolución dirigida de proteínas". Peine. Chem. Pantalla de alto rendimiento . 9 (4): 271–288. doi : 10.2174 / 138620706776843192 . PMID 16724918 .
- ^ Füllen, G .; Youvan DC (1994). "Algoritmos genéticos y mutagénesis de conjuntos recursivos en ingeniería de proteínas". Complejo Int . 1 .
- ^ Wong, TS; Roccatano, D .; Zacharias, M .; Schwaneberg, U. (2006). "Un análisis estadístico de métodos de mutagénesis aleatoria utilizados para la evolución de proteínas dirigida". J. Mol. Biol . 355 (4): 858–871. doi : 10.1016 / j.jmb.2005.10.082 . PMID 16325201 .
- ^ Wong, TS; Tee, KL; Hauer, B .; Schwaneberg, U. (2004). "Mutagénesis de saturación de secuencia (SeSaM): un método novedoso para la evolución de proteínas dirigida" . Ácidos nucleicos Res . 32 (3): e26. doi : 10.1093 / nar / gnh028 . PMC 373423 . PMID 14872057 .
- ^ Wong, TS; Tee, KL; Hauer, B .; Schwaneberg, U. (2005). "Mutagénesis de saturación de secuencia con frecuencias de mutación sintonizables". Anal. Biochem . 341 (1): 187–189. doi : 10.1016 / j.ab.2005.03.023 . PMID 15866543 .
- ^ Wong, TS; Roccatano, D .; Loakes, D .; Tee, KL; Schenk, A .; Hauer, B .; Schwaneberg, U. (2008). "Mutagénesis de saturación de secuencia enriquecida por transversión (SeSaM-Tv +): un método de mutagénesis aleatoria con intercambios de nucleótidos consecutivos que complementa el sesgo de la PCR propensa a errores". Biotechnol. J . 3 (1): 74–82. doi : 10.1002 / biot.200700193 . PMID 18022859 .
- ^ d'Abbadie, M .; Hofreiter, M .; Vaisman, A .; Loakes, D .; Gasparutto, D .; Cadet, J .; Woodgate, R .; Pääbo, S .; Holliger, P. (2007). "Cría molecular de polimerasas para amplificación de ADN antiguo" . Nat. Biotechnol . 25 (8): 939–943. doi : 10.1038 / nbt1321 . PMC 1978225 . PMID 17632524 .
- ^ Mundhada, H .; Marienhagen, J .; Scacioc, A .; Schenk, A .; Roccatano, D .; Schwaneberg, U. (2011). "SeSaM-Tv-II genera un espacio de secuencia de proteínas que no se puede obtener mediante epPCR". ChemBioChem . 12 (10): 1595–1601. doi : 10.1002 / cbic.201100010 . PMID 21671328 .
- ^ Ruff, AJ; Marienhagen, J .; Verma, R .; Roccatano, D .; Genieser, H.-G .; Niemann, R .; Shivange, AV; Schwaneberg, U. (2012). "dRTP y dPTP un par de nucleótidos complementarios para el método de mutagénesis de saturación de secuencia (SeSaM)". J Mol Catal B-Enzym . 84 : 40–47. doi : 10.1016 / j.molcatb.2012.04.018 .
- ^ Zhao, J .; Kardashliev, T .; Ruff, AJ; Bocola, M .; Schwaneberg, M. (2014). "Lecciones de la diversidad de experimentos de evolución dirigida mediante un análisis de 3000 mutaciones". Biotechnol Bioeng . 111 (2): 2380–2389. doi : 10.1002 / bit.25302 . PMID 24904008 .
- ^ Pottkämper, J .; Barthen, P .; Ilmberger, N .; Schwaneberg, U .; Schenk, A .; Schulte, M .; Ignatiev, N .; Streit, W. (2009). "Aplicación de la metagenómica para la identificación de celulasas bacterianas estables en líquidos iónicos". Green Chem . 11 (7): 957–965. doi : 10.1039 / B820157A .
- ^ Li, Z .; Roccatano, D .; Lorenz, M .; Schwaneberg, U. (2012). "Evolución dirigida de subtilisina E en una proteasa altamente activa y tolerante al cloruro de guanidinio y al dodecilsulfato de sodio". ChemBioChem . 13 (5): 691–699. doi : 10.1002 / cbic.201100714 . PMID 22408062 .
- ^ Gutiérrez, EA; Mundhada, H .; Meier, T .; Duefuel, H .; Bocola, M .; Schwaneberg, U. (2013). "Glucosa oxidasa rediseñada para determinación de glucosa amperométrica en análisis de diabetes". Biosens. Bioelectron . 50 : 84–90. doi : 10.1016 / j.bios.2013.06.029 . PMID 23835222 .
- ^ Shivange, AV; Roccatano, D .; Schwaneberg, U. (2016). "Interrogación iterativa de residuos clave de una fitasa con sustituciones que aumentan la termoestabilidad identificadas en la evolución dirigida" . Apl. Microbiol. Biot . 100 (1): 227–242. doi : 10.1007 / s00253-015-6959-5 . PMID 26403922 . S2CID 10424164 .
- ^ Belsare, KD; Horn, T .; Ruff, AJ; Martínez, R .; Magnusson, A .; Holtmann, D .; Schrader, J .; Schwaneberg, U. (2017). "Evolución dirigida de P450cin para transferencia de electrones mediada" . Prot. Ing. Des. Sel . 30 (2): 119-127. doi : 10.1093 / protein / gzw072 . PMID 28007937 .