El punto de control del huso , también conocido como la transición de metafase a anafase , el punto de control de ensamblaje del huso (SAC) o el punto de control mitótico , es un punto de control del ciclo celular durante la mitosis o meiosis que evita la separación de los cromosomas duplicados ( anafase ) hasta cada El cromosoma está adherido correctamente al huso . Para lograr una segregación adecuada, los dos cinetocoros de las cromátidas hermanas deben unirse a polos de huso opuestos (orientación bipolar). [1]Solo este patrón de unión garantizará que cada célula hija reciba una copia del cromosoma. La característica bioquímica definitoria de este punto de control es la estimulación del complejo promotor de anafase por complejos de ciclina-CDK de fase M , que a su vez provoca la destrucción proteolítica de ciclinas y proteínas que mantienen unidas las cromátidas hermanas . [2]
Resumen e importancia
El comienzo de la metafase se caracteriza por la conexión de los microtúbulos a los cinetocoros de los cromosomas, así como por la alineación de los cromosomas en el centro de la célula. Cada cromátida tiene su propio cinetocoro, y todos los microtúbulos que están unidos a los cinetocoros de las cromátidas hermanas irradian desde los polos opuestos de la célula. Estos microtúbulos ejercen una fuerza de tracción sobre los cromosomas hacia los extremos opuestos de las células, mientras que la cohesión entre las cromátidas hermanas se opone a esta fuerza.
En la transición de la metafase a la anafase, esta cohesión entre las cromátidas hermanas se disuelve, y los microtúbulos del huso empujan las cromátidas separadas hacia lados opuestos de la célula. Las cromátidas están además separadas por el movimiento físico de los propios polos del huso. La disociación prematura de las cromátidas puede provocar una segregación errónea de los cromosomas y aneuploidía en las células hijas. Por lo tanto, el trabajo del punto de control de la metafase es evitar esta transición a la anafase hasta que los cromosomas estén correctamente unidos, antes de que las cromátidas hermanas se separen.
Para preservar la identidad de la célula y su función adecuada, es necesario mantener el número apropiado de cromosomas después de cada división celular . Un error en la generación de células hijas con menor o mayor número de cromosomas de lo esperado (una situación denominada aneuploidía ), puede conducir en el mejor de los casos a la muerte celular, o alternativamente puede generar resultados fenotípicos catastróficos . [3] [4] Los ejemplos incluyen:
- En las células cancerosas, la aneuploidía es un evento frecuente, lo que indica que estas células presentan un defecto en la maquinaria involucrada en la segregación cromosómica , así como en el mecanismo que asegura que la segregación se realice correctamente.
- En los seres humanos, el síndrome de Down aparece en niños que llevan en sus células una copia extra del cromosoma 21 , como resultado de un defecto en la segregación cromosómica durante la meiosis en uno de los progenitores. Este defecto generará un gameto (espermatozoide u ovocito) con un cromosoma 21 extra. Después de la fertilización , este gameto generará un embrión con tres copias del cromosoma 21.
Descubrimiento del punto de control de montaje del husillo (SAC)
Zirkle (en 1970) fue uno de los primeros investigadores en observar que, cuando un solo cromosoma se retrasa para llegar a la placa de metafase, el inicio de la anafase se pospone hasta algunos minutos después de su llegada. [5] Esta observación, junto con otras similares, sugirió que existe un mecanismo de control en la transición de metafase a anafase. Usando fármacos como el nocodazol y la colchicina , el huso mitótico se desmonta y el ciclo celular se bloquea en la transición de metafase a anafase. Usando estos fármacos (ver la revisión de Rieder y Palazzo en 1992 [6] ), el mecanismo de control putativo se denominó Spindle Assembly Checkpoint (SAC). Este mecanismo regulador se ha estudiado intensamente desde entonces. [7]
Utilizando diferentes tipos de estudios genéticos, se ha establecido que diversos tipos de defectos son capaces de activar el SAC: despolimerización del huso, [8] [9] la presencia de cromosomas dicéntricos (con dos centrómeros), [10] centrómeros segregándose en un forma aberrante, [11] defectos en los cuerpos de los polos del huso en S. cerevisiae , [12] defectos en las proteínas del cinetocoro, [13] mutaciones en el ADN centromérico [14] o defectos en los motores moleculares activos durante la mitosis. [8] Un resumen de estas observaciones se puede encontrar en el artículo de Hardwick y colaboradores en 1999. [15]
Utilizando sus propias observaciones, Zirkle [5] fue el primero en proponer que "alguna (...) sustancia, necesaria para que la célula pase a la anafase, aparece unos minutos después de C (momento de la llegada del último cromosoma a la placa de metafase) , o después de un cambio drástico en la condición citoplásmica , justo en C o inmediatamente después de C ", lo que sugiere que esta función se localiza en cinetocoros no adheridos al huso mitótico. McIntosh amplió esta propuesta, sugiriendo que una enzima sensible a la tensión ubicada en los centrómeros produce un inhibidor del inicio de la anafase cuando los dos cinetocoros hermanos no están bajo tensión bipolar. [16] De hecho, los datos disponibles sugirieron que la señal "esperar para entrar en anafase" se produce principalmente en o cerca de cinetocoros no conectados. [17] Sin embargo, el evento principal asociado a la unión del cinetocoro al huso, que es capaz de inactivar la señal inhibidora y liberar la detención de la metafase, podría ser la adquisición de microtúbulos por el cinetocoro (como propusieron Rieder y colaboradores en 1995 [17] ), o la tensión que estabiliza el anclaje de los microtúbulos a los cinetocoros (como sugieren los experimentos realizados en el laboratorio de Nicklas [18] ). Estudios posteriores en células que contienen dos husos mitóticos independientes en un único citoplasma mostraron que el inhibidor de la transición de metafase a anafase se genera mediante cinetocoros no unidos y no se difunde libremente en el citoplasma. [19] Sin embargo, en el mismo estudio se demostró que, una vez que se inicia la transición de la metafase a la anafase en una parte de la célula, esta información se extiende a lo largo del citoplasma y puede superar la señal "esperar para entrar en anafase". asociado a un segundo huso que contiene cinetocoros independientes.
Antecedentes de la duplicación, cohesión y segregación de cromátidas hermanas
División celular: duplicación de material y distribución a células hijas.
Cuando las células están listas para dividirse, porque el tamaño celular es lo suficientemente grande o porque reciben el estímulo apropiado, [20] activan el mecanismo para entrar en el ciclo celular y duplican la mayoría de los orgánulos durante la fase S (síntesis), incluido su centrosoma. . Por lo tanto, cuando termine el proceso de división celular, cada célula hija recibirá un conjunto completo de orgánulos. Al mismo tiempo, durante la fase S, todas las células deben duplicar su ADN con mucha precisión, un proceso denominado replicación del ADN . Una vez finalizada la replicación del ADN, en eucariotas la molécula de ADN se compacta y condensa, para formar los cromosomas mitóticos , cada uno constituido por dos cromátidas hermanas , que se mantienen unidas por el establecimiento de cohesión entre ellas; cada cromátida es una molécula de ADN completa, unida a través de microtúbulos a uno de los dos centrosomas de la célula en división, ubicada en los polos opuestos de la célula. La estructura formada por los centrosomas y los microtúbulos recibe el nombre de huso mitótico , debido a su forma característica, que contiene los cromosomas entre los dos centrosomas. Ambas cromátidas hermanas permanecen juntas hasta la anafase ; en este momento se separan y viajan hacia el centrosoma al que están adheridos. De esta forma, cuando las dos células hijas se separen al final del proceso de división, cada una recibirá un juego completo de cromátidas. El mecanismo responsable de la correcta distribución de las cromátidas hermanas durante la división celular se denomina segregación cromosómica .
Para garantizar que la segregación cromosómica se lleve a cabo correctamente, las células han desarrollado un mecanismo complejo y preciso. En primer lugar, las células deben coordinar la duplicación del centrosoma con la replicación del ADN, y una falla en esta coordinación generará husos mitóticos monopolares o multipolares, que generalmente producirán una segregación cromosómica anormal, [21] porque en este caso no se producirá la distribución cromosómica. de forma equilibrada.
Mitosis: anclaje de cromosomas al huso y segregación cromosómica
Durante la fase S, el centrosoma comienza a duplicarse. Justo al comienzo de la mitosis, ambos centriolos alcanzan su longitud máxima, reclutan material adicional y aumenta su capacidad para nuclear microtúbulos. A medida que avanza la mitosis, ambos centrosomas se separan para generar el huso mitótico. [22] De esta manera, el huso mitótico tiene dos polos que emanan microtúbulos. Los microtúbulos (MT) son filamentos proteicos largos, con extremidades asimétricas: un extremo denominado "menos" (-) extremo, relativamente estable y cercano al centrosoma, y un extremo denominado "más" (+), con fases alternas de crecimiento y retracción, explorando el centro de la célula buscando los cromosomas. Cada cromátida tiene una región especial, denominada centrómero , sobre la cual se ensambla una estructura proteica denominada cinetocoro , que es capaz de estabilizar el microtúbulo más el extremo. Por lo tanto, si por casualidad un microtúbulo que explora el centro de la célula encuentra un cinetocoro, puede suceder que el cinetocoro lo capture, de modo que el cromosoma se adhiera al huso a través del cinetocoro de una de sus cromátidas hermanas. El cromosoma juega un papel activo en la unión de los cinetocoros al huso. Unido a la cromatina hay un factor de intercambio de nucleótidos de guanina Ran (GEF) que estimula el Ran citosólico cerca del cromosoma para que se una a GTP en lugar de GDP. La forma de Ran activada unida a GTP libera proteínas estabilizadoras de microtúbulos, como TPX2, a partir de complejos de proteínas en el citosol, lo que induce la nucleación y polimerización de los microtúbulos alrededor de los cromosomas. [23] Estos microtúbulos derivados del cinetocoro, junto con las proteínas motoras de la quinesina en el cinetocoro externo, facilitan las interacciones con la superficie lateral de un microtúbulo derivado del polo del huso. Sin embargo, estos accesorios laterales son inestables y deben convertirse en un accesorio de extremo. La conversión de uniones laterales a uniones terminales permite que el crecimiento y la contracción de los extremos positivos de los microtúbulos se conviertan en fuerzas que empujan y tiran de los cromosomas para lograr la bi-orientación adecuada. Como sucede que las cromátidas hermanas están unidas entre sí y ambos cinetocoros están ubicados uno al lado del otro en ambas cromátidas, cuando un cinetocoro se une a un centrosoma, el cinetocoro hermano queda expuesto al centrosoma ubicado en el polo opuesto; por esta razón, en la mayoría de los casos, el segundo cinetocoro se asocia al centrosoma en el polo opuesto, a través de sus microtúbulos, [24] de modo que los cromosomas se vuelven "bi-orientados", una configuración fundamental (también llamada anfitelio ) para asegurar que el cromosoma la segregación se llevará a cabo correctamente cuando la célula se divida. [25] [26] Ocasionalmente, uno de los dos cinetocoros hermanos puede adherirse simultáneamente a los MT generados por ambos polos, una configuración denominada merotélica , que no es detectada por el punto de control del huso pero que puede generar cromosomas rezagados durante la anafase y, en consecuencia, aneuploidía . La orientación merotélica (caracterizada por la ausencia de tensión entre cinetocoros hermanos) es frecuente al inicio de la mitosis, pero la proteína Aurora B (una quinasa conservada de levadura a vertebrados) detecta y elimina este tipo de anclajes. [27] (Nota: Aurora B se sobreexpresa con frecuencia en varios tipos de tumores y actualmente es un objetivo para el desarrollo de medicamentos contra el cáncer. [28] )
Cohesión de cromátidas hermanas durante la mitosis
Cohesina: proteínas SMC
Como se ha señalado anteriormente, las cromátidas hermanas permanecen asociadas desde la fase S (cuando el ADN se replica para generar dos copias idénticas, las dos cromátidas) hasta la anafase. En este punto, las dos cromátidas hermanas se separan y viajan a polos opuestos en la célula en división. Los estudios genéticos y bioquímicos en levaduras y extractos de huevo en Xenopus laevis identificaron un complejo de poliproteínas como un actor esencial en la cohesión de las cromátidas hermanas (ver la revisión de Hirano en 2000 [29] ). Este complejo se conoce como complejo de cohesina y en Saccharomyces cerevisiae está compuesto por al menos cuatro subunidades: Smc1p, Smc3p, Scc1p (o Mcd1p) y Scc3p. Tanto Smc1p como Smc3p pertenecen a la familia de proteínas para el Mantenimiento Estructural de los Cromosomas (SMC), que constituyen un grupo de ATPasas cromosómicas altamente conservadas, y forman un heterodímero (Smc1p / Smc3p). Scc1p es el homólogo en S. cerevisiae de Rad21, identificado por primera vez como una proteína involucrada en la reparación del ADN en S. pombe . Estas cuatro proteínas son esenciales en la levadura y una mutación en cualquiera de ellas producirá una separación prematura de las cromátidas hermanas. En la levadura, la cohesina se une a sitios preferenciales a lo largo de los brazos cromosómicos y es muy abundante cerca de los centrómeros, como se demostró en un estudio que utilizó inmunoprecipitación de cromatina. [30]
El papel de la heterocromatina
Las observaciones citológicas clásicas sugirieron que las cromátidas hermanas están más fuertemente unidas en las regiones heterocromáticas , [31] y esto sugirió que la estructura o composición especial de la heterocromatina podría favorecer el reclutamiento de cohesina. [32] De hecho, se ha demostrado que Swi6 (el homólogo de HP-1 en S. pombe ) se une a Lys 9 metilado de histona H3 y promueve la unión de cohesina a las repeticiones centroméricas en S. pombe . [33] [34] Estudios más recientes indican que la maquinaria del ARNi regula el establecimiento de heterocromatina, que a su vez recluta cohesina en esta región, tanto en S. pombe [35] como en células de vertebrados. [36] Sin embargo, debe haber otros mecanismos además de la heterocromatina para asegurar una cohesión aumentada en los centrómeros, porque S. cerevisiae carece de heterocromatina junto a los centrómeros, pero la presencia de un centrómero funcional induce un aumento de la asociación de cohesina en una región contigua, que abarca 20 -50kb. [37]
En esta dirección, Orc2 (una proteína incluida en el complejo de reconocimiento de origen , ORC, implicada en el inicio de la replicación del ADN durante la fase S ) también se localiza en cinetocoros durante la mitosis en células humanas; [38] de acuerdo con esta localización, algunas observaciones indican que Orc2 en la levadura está implicado en la cohesión de las cromátidas hermanas, y su eliminación induce la activación de SAC. [39] También se ha observado que otros componentes del complejo ORC (como orc5 en S. pombe ) están implicados en la cohesión. [40] Sin embargo, la vía molecular que involucra a las proteínas ORC parece ser aditiva a la vía de las cohesinas, y en su mayor parte se desconoce.
Función de cohesión y su disolución.
La cohesión centromérica resiste las fuerzas ejercidas por los microtúbulos del huso hacia los polos, que generan tensión entre cinetocoros hermanos. A su vez, esta tensión estabiliza la unión microtúbulo-cinetocoro, a través de un mecanismo que implica a la proteína Aurora B (una revisión sobre este tema: Hauf y Watanabe 2004 [41] ).
De hecho, una disminución en los niveles celulares de cohesina genera la separación prematura de las cromátidas hermanas, así como defectos en la congresión cromosómica en la placa metafásica y deslocalización de las proteínas en el complejo pasajero cromosómico , que contiene la proteína Aurora B. [42] [43] La estructura propuesta para el complejo de cohesina sugiere que este complejo conecta directamente ambas cromátidas hermanas. [44] En esta estructura propuesta, los componentes SMC de la cohesina juegan un papel estructural, de modo que el heterodímero SMC puede funcionar como una proteína de unión al ADN, cuya conformación está regulada por ATP . [45] Scc1p y Scc3p, sin embargo, desempeñarían una función reguladora. [29]
En S. cerevisiae , Pds1p (también conocida como securina ) regula la cohesión de las cromátidas hermanas, porque se une e inhibe la proteasa Esp1p ( separina o separasa ). Cuando se desencadena el inicio de la anafase , el complejo promotor de la anafase ( APC / C o Ciclosoma) degrada la securina. APC / C es una ubiquitina ligasa de anillo E3 que recluta una enzima conjugadora de ubiquitina E2 cargada con ubiquitina. Securin se reconoce solo si Cdc20, la subunidad activadora, está unida al núcleo APC / C. Cuando securin, Cdc20 y E2 están todos unidos a APC / C, E2 ubiquitina a securin y la degrada selectivamente. La degradación de la securina libera la proteasa Esp1p / separasa, que degrada los anillos de cohesina que unen las dos cromátidas hermanas, promoviendo así la separación de las cromátidas hermanas. [46] También se ha demostrado que la quinasa Polo / Cdc5 fosforila los residuos de serina próximos al sitio de corte para Scc1, y esta fosforilación facilitaría la actividad de corte. [47]
Aunque esta maquinaria se conserva a través de la evolución, [48] [49] en los vertebrados la mayoría de las moléculas de cohesina se liberan en profase, independientemente de la presencia de APC / C, en un proceso dependiente de Polo-like 1 ( PLK1 ) y Aurora B. [50] Sin embargo, se ha demostrado que una pequeña cantidad de Scc1 permanece asociada a los centrómeros en las células humanas hasta la metafase, y una cantidad similar se corta en la anafase, cuando desaparece de los centrómeros. [51] Por otro lado, algunos experimentos muestran que la cohesión de las cromátidas hermanas en los brazos se pierde gradualmente después de que los centrómeros hermanos se han separado y las cromátidas hermanas se mueven hacia los polos opuestos de la célula. [52] [53]
Según algunas observaciones, una fracción de cohesinas en los brazos cromosómicos y las cohesinas centroméricas están protegidas por la proteína Shugoshin (Sgo1), evitando su liberación durante la profase. [54] [55] Para poder funcionar como protector de la cohesión centromérica, Sgo1 debe inactivarse al comienzo de la anafase, así como Pds1p. De hecho, tanto Pds1p como Sgo1 son sustratos de APC / C en vertebrados. [56]
Descripción general del punto de control del ensamblaje del husillo
El punto de control del ensamblaje del huso (SAC) es una señal activa producida por cinetocoros mal adheridos , que se conserva en todos los eucariotas . El SAC detiene el ciclo celular regulando negativamente CDC20, evitando así la activación de las actividades de poliubiquitilación del complejo promotor de anafase (APC). Las proteínas responsables de la señal de SAC componen el complejo de punto de control mitótico (MCC), que incluye proteínas SAC, MAD2 / MAD3 (deficiencia de detención mitótica), BUB3 (gemación no inhibida por benzimidazol) y CDC20 . [57] Otras proteínas involucradas en el SAC incluyen MAD1 , BUB1 , MPS1 , y Aurora B . Para eucariotas superiores, los reguladores adicionales del SAC incluyen componentes del complejo ROD-ZW10 , cometa p31 , MAPK , CDK1-ciclina-B , NEK2 y PLK1 . [58]
Activación del punto de control
El SAC monitorea la interacción entre los cinetocoros conectados incorrectamente y los microtúbulos del huso , y se mantiene hasta que los cinetocoros se adhieren correctamente al huso. Durante la prometafase , CDC20 y las proteínas SAC se concentran en los cinetocoros antes de la unión al ensamblaje del huso. Estas proteínas mantienen el SAC activado hasta que se eliminan y se realiza la unión correcta cinetocoro-microtúbulos. Incluso un solo cinetocoro no adjunto puede mantener el punto de control del husillo. [57] Después de la unión de los extremos positivos de los microtúbulos y la formación de los microtúbulos del cinetocoro, MAD1 y MAD2 se agotan del ensamblaje del cinetocoro. Otro regulador de la activación del punto de control es la tensión del cinetocoro. Cuando los cinetocoros hermanos están correctamente unidos a los polos del huso opuestos, las fuerzas en el huso mitótico generan tensión en los cinetocoros. Los cinetocoros hermanos bi-orientados estabilizan el conjunto cinetocoro-microtúbulos, mientras que la tensión débil tiene un efecto desestabilizador. En respuesta a las uniones de cinetocoro incorrectas, como la unión sintélica , donde ambos cinetocoros se unen a un polo del eje, la tensión débil generada desestabiliza la unión incorrecta y permite que el cinetocoro se vuelva a unir correctamente al cuerpo del eje. Durante este proceso, los cinetocoros que están unidos al huso mitótico pero que no están bajo tensión activan el punto de control del huso. La quinasa Aurora-B / Ipl1 del complejo pasajero cromosómico funciona como sensor de tensión en uniones cinetocoro incorrectas. Detecta y desestabiliza las uniones incorrectas mediante el control de la kinesina MCAK de KINI que corta los microtúbulos, el complejo DASH y el complejo Ndc80 / Hec1 [59] en la interfase microtúbulo-cinetocoro. [58] La quinasa Aurora-B / Ipl1 también es fundamental para corregir las uniones merotélicas , donde un cinetocoro se une simultáneamente a ambos polos del huso. Las uniones merotélicas generan suficiente tensión y no son detectadas por el SAC, y sin corrección, pueden resultar en una mala segregación cromosómica debido a la lenta velocidad de migración de las cromátidas. Si bien la unión de los microtúbulos se requiere de forma independiente para la activación de la SAC, no está claro si la tensión es un regulador independiente de la SAC, aunque está claro que con la tensión surgen diferentes comportamientos regulatorios.
Una vez activado, los bloques de husillo de control anafase entrada mediante la inhibición de la anafase de la promoción de complejos a través de la regulación de la actividad de control mitótico complejo. El mecanismo de inhibición de APC por el complejo de punto de control mitótico es poco conocido, aunque se hipotetiza que el MCC se une a APC como un pseudosustrato usando el motivo KEN-box en BUBR1 . Al mismo tiempo que se activa el complejo del punto de control mitótico, la proteína centrómero CENP-E activa BUBR1, que también bloquea la anafase. [58]
Formación de complejos de puntos de control mitóticos
El complejo del punto de control mitótico está compuesto por BUB3 junto con MAD2 y MAD3 unidos a Cdc20 . MAD2 y MAD3 tienen distintos sitios de unión en CDC20 y actúan sinérgicamente para inhibir APC / C. El complejo MAD3 está compuesto por BUB3, que se une a Mad3 y BUB1B a través del motivo lineal corto conocido como motivo GLEBS. Se desconoce el orden exacto de los anexos que deben realizarse para formar el MCC. Es posible que Mad2-Cdc20 forme un complejo al mismo tiempo que BUBR1-BUB3-Cdc20 forme otro complejo y, en consecuencia, estos dos subcomplejos se combinen para formar el complejo de punto de control mitótico. [57] En las células humanas, la unión de BUBR1 a CDC20 requiere la unión previa de MAD2 a CDC20, por lo que es posible que el subcomplejo MAD2-CDC20 actúe como un iniciador para la formación de MCC. El agotamiento de BUBR1 conduce solo a una reducción leve en los niveles de Mad2-Cdc20, mientras que Mad2 es necesaria para la unión de BubR1-Bub3 a Cdc20. Sin embargo, BUBR1 sigue siendo necesario para la activación del punto de control. [58]
El mecanismo de formación de la MCC no está claro y existen teorías en competencia tanto para la formación dependiente de cinetocoro como para la independiente de cinetocoro. En apoyo de la teoría independiente del cinetocoro, el MCC es detectable en células de S. cerevisiae en las que se han mutado las proteínas de ensamblaje del kinetocore del núcleo y en las células en las que se ha desactivado el SAC, lo que sugiere que el MCC podría ensamblarse durante la mitosis sin localización del cinetocoro. En un modelo, los cinetocoros de prometafase no unidos pueden "sensibilizar" a las APC a la inhibición de MCC al reclutar las APC a los cinetocoros a través de un SAC en funcionamiento. Además, las reducciones de varias proteínas SAC han revelado que las reducciones de MAD2 y BUBR1 afectan el momento de la mitosis independientemente de los cinetocoros, mientras que las reducciones de otras proteínas SAC dan como resultado un SAC disfuncional sin alterar la duración de la mitosis. Por lo tanto, es posible que el SAC funcione a través de un temporizador de dos etapas donde MAD2 y BUBR1 controlan la duración de la mitosis en la primera etapa, que puede extenderse en la segunda etapa si hay cinetocoros no unidos así como otras proteínas SAC. [58] Sin embargo, hay líneas de evidencia que están en contra de la asamblea independiente del cinetocoro. El MCC aún no se ha encontrado durante la interfase , mientras que el MCC no se forma a partir de sus constituyentes en los extractos de X. laevis meiosis II sin la adición de espermatozoides de núcleos y nocodazol para prevenir el ensamblaje del huso.
El modelo principal de formación de MCC es el "modelo de plantilla MAD2", que depende de la dinámica del cinetocoro de MAD2 para crear el MCC. MAD1 se localiza en cinetocoros no unidos mientras se une fuertemente a MAD2. La localización de MAD2 y BubR1 al cinetocoro también puede ser dependiente de la quinasa Aurora B . [60] Las células que carecen de Aurora B no se detienen en la metafase incluso cuando los cromosomas carecen de unión a los microtúbulos. [61] Los cinetocoros no unidos primero se unen a un complejo de cometas MAD1-C-MAD2-p31 y liberan el cometa p31 a través de mecanismos desconocidos. El complejo MAD-C-MAD2 resultante recluta el conformador abierto de Mad2 (O-Mad2) a los cinetocoros. Este O-Mad2 cambia su conformación a Mad2 cerrada (C-Mad2) y une Mad1. Este complejo Mad1 / C-Mad2 es responsable del reclutamiento de más O-Mad2 a los cinetocoros, que cambia su conformación a C-Mad2 y se une a Cdc20 en una reacción de autoamplificación. Dado que MAD1 y CDC20 contienen ambos un motivo de unión a MAD2 similar, la conformación de O-MAD2 vacía cambia a C-MAD2 mientras se une a CDC20. Este bucle de retroalimentación positiva está regulado negativamente por el cometa p31 , que se une competitivamente a C-MAD2 unido a MAD1 o CDC20 y reduce la unión adicional de O-MAD2 a C-MAD2. También pueden existir otros mecanismos de control, considerando que el cometa p31 no está presente en eucariotas inferiores. La nomenclatura del 'modelo de plantilla' se deriva, por tanto, del proceso en el que MAD1-C-MAD2 actúa como plantilla para la formación de copias de C-MAD2-CDC20. Este secuestro de Cdc20 es esencial para mantener el punto de control del husillo. [57]
Desactivación del punto de control
Existen varios mecanismos para desactivar el SAC después de la biorientación correcta de las cromátidas hermanas . Tras la unión microtúbulo-cinetocoro, un mecanismo de extracción a través de un complejo motor dineína-dineína transporta las proteínas del punto de control del huso lejos de los cinetocoros. [58] Las proteínas despojadas, que incluyen MAD1, MAD2, MPS1 y CENP-F , se redistribuyen luego a los polos del huso . El proceso de extracción depende en gran medida de la estructura de los microtúbulos en buen estado, así como de la motilidad de la dineína a lo largo de los microtúbulos. Además de funcionar como un regulador del bucle de retroalimentación positiva C-MAD2, el cometa p31 también puede actuar como un desactivador del SAC. Los cinetocoros no unidos inactivan temporalmente el cometa p31 , pero la unión reactiva la proteína e inhibe la activación de MAD2, posiblemente por fosforilación inhibidora. Otro posible mecanismo de inactivación de SAC resulta de la disociación dependiente de energía del complejo MAD2-CDC20 a través de la ubiquitilación no degradativa de CDC20. Por el contrario, se requiere la enzima deubiquitilante protectina para mantener el SAC. Por lo tanto, los cinetocoros independientes mantienen el punto de control recreando continuamente el subcomplejo MAD2-CDC20 a partir de sus componentes. El SAC también puede desactivarse mediante proteólisis inducida por activación de APC . Dado que la SAC no se reactiva por la pérdida de cohesión de la cromátida hermana durante la anafase, la proteólisis de la ciclina B y la inactivación de la quinasa CDK1-ciclina-B también inhibe la actividad de la SAC. La degradación de MPS1 durante la anafase evita la reactivación de SAC después de la eliminación de la cohesión de cromátidas hermanas. Después de la desactivación del punto de control y durante la anafase normal del ciclo celular, el complejo promotor de la anafase se activa mediante la disminución de la actividad de MCC. Cuando esto sucede, el complejo enzimático poliubiquitina al inhibidor de la anafase securina . La ubiquitinación y destrucción de la securina al final de la metafase libera la proteasa activa llamada separasa. Separase escinde las moléculas de cohesión que mantienen unidas las cromátidas hermanas para activar la anafase. [23]
Nuevo modelo para la desactivación de SAC en S. cerevisiae : el interruptor mecánico
Se ha sugerido un nuevo mecanismo para explicar cómo la unión de microtúbulos de extremo en el cinetocoro puede interrumpir pasos específicos en la señalización de SAC. En un cinetocoro no unido, el primer paso en la formación del MCC es la fosforilación de Spc105 por la quinasa Mps1. La Spc105 fosforilada es entonces capaz de reclutar las proteínas de señalización aguas abajo Bub1 y 3; Mad 1,2 y 3; y Cdc20. La asociación con Mad1 en cinetocoros independientes hace que Mad2 experimente un cambio conformacional que la convierte de una forma abierta (O-Mad2) a una forma cerrada (C-Mad2). El C-Mad2 unido a Mad1 luego se dimeriza con un segundo O-Mad2 y cataliza su cierre alrededor de Cdc20. Este complejo C-Mad2 y Cdc20, el MCC, deja Mad1 y C-Mad2 en el cinetocoro para formar otro MCC. Cada uno de los MCC secuestra dos moléculas de Cdc20 para evitar su interacción con el APC / C, manteniendo así el SAC. [23] La fosforilación de Mps1 de Spc105 es necesaria y suficiente para iniciar la vía de señalización del SAC, pero este paso solo puede ocurrir en ausencia de la unión de los microtúbulos al cinetocoro. Se muestra que la Mps1 endógena se asocia con el dominio de homología de calponina (CH) de Ndc80, que se encuentra en la región del cinetocoro exterior que está distante del cromosoma. Aunque Mps1 está acoplado en el cinetocoro exterior, todavía es capaz de localizarse dentro del cinetocoro interior y fosforilar Spc105 debido a las regiones de bisagra flexible en Ndc80. Sin embargo, el modelo de interruptor mecánico propone que la unión de un microtúbulo al cinetocoro desactiva el SAC a través de dos mecanismos. La presencia de un microtúbulo unido aumenta la distancia entre el dominio CH de Ndc80 y Spc105. Además, Dam1 / DASH, un gran complejo que consta de 160 proteínas que forma un anillo alrededor del microtúbulo adherido, actúa como una barrera entre las dos proteínas. La separación evita las interacciones entre Mps1 y Spc105 y, por tanto, inhibe la vía de señalización de SAC. [62]
Es importante señalar que este modelo no es aplicable a la regulación de SAC en organismos de orden superior, incluidos los animales. Una faceta principal del mecanismo de interruptor mecánico es que en S. cerevisiae la estructura del cinetocoro solo permite la unión de un microtúbulo. Los cinetocoros en animales, por otro lado, son mallas mucho más complejas que contienen sitios de unión para una multitud de microtúbulos. [63] La unión de los microtúbulos en todos los sitios de unión del cinetocoro no es necesaria para la desactivación del SAC y la progresión a la anafase. Por lo tanto, los estados unidos a microtúbulos y no unidos a los microtúbulos coexisten en el cinetocoro animal mientras que el SAC está inhibido. Este modelo no incluye una barrera que evitaría que Mps1 asociado con un cinetocoro adjunto fosforilara Spc105 en un cinetocoro adyacente no adjunto. Además, el complejo de levadura Dam1 / DASH no está presente en las células animales.
Defectos del punto de control del huso y cáncer
Cuando el punto de control del huso no funciona correctamente, esto puede provocar una segregación cromosómica errónea, aneuploidía e incluso tumorigénesis . [58] La transformación ocurre y se acelera cuando el mantenimiento de la integridad genómica se rompe, especialmente a nivel general de cromosomas completos o grandes porciones de ellos. De hecho, la aneuploidía es la característica más común de los tumores sólidos humanos y, por lo tanto, el punto de control del ensamblaje del huso podría considerarse como un posible objetivo para la terapia antitumoral. [64] Este es un hecho muy subestimado, ya que se piensa principalmente que las mutaciones en genes específicos conocidos como oncogenes o supresores de tumores están detrás de la inestabilidad genética y la tumorigénesis. Por lo general, los diversos puntos de control en el ciclo celular se encargan de la integridad genómica a través de mecanismos redundantes altamente conservados que son importantes para mantener la homeostasis celular y prevenir la tumorigénesis. Varias proteínas de punto de control de ensamblaje del huso actúan como reguladores positivos y negativos para garantizar la segregación cromosómica adecuada en cada ciclo celular, lo que evita la inestabilidad cromosómica (CIN), también conocida como inestabilidad del genoma .
La integridad genómica ahora se aprecia en varios niveles donde algunos tumores muestran inestabilidad manifestada como sustituciones, inserciones y deleciones de bases, mientras que la mayoría muestra ganancias o pérdidas de cromosomas completos. [sesenta y cinco]
Debido al hecho de que las alteraciones en las proteínas reguladoras mitóticas pueden conducir a la aneuploidía y este es un evento frecuente en el cáncer , [66] inicialmente se pensó que estos genes podrían estar mutados en tejidos cancerosos. [67]
Genes mutados en cánceres
En algunos cánceres, los genes que subyacen a los defectos que dan lugar a la transformación están bien caracterizados. En los cánceres hematológicos, como el mieloma múltiple, las anomalías citogenéticas son muy comunes debido a la naturaleza inherente de las roturas del ADN necesarias para el reordenamiento del gen de las inmunoglobulinas. Sin embargo, los defectos en proteínas como MAD2 que funcionan predominantemente en el SAC también se caracterizan en el mieloma múltiple. [68] La mayoría de los tumores sólidos también son predominantemente aneuploides. Para el cáncer colorrectal, BUB1 y BUBR1 y la amplificación de STK15 son reguladores clave que han sido implicados en la inestabilidad genómica que resulta en cáncer. [69] En el cáncer de mama, la forma genética caracterizada por el gen BRCA-1 exhibe mayores niveles de inestabilidad genómica que las formas esporádicas. Los experimentos mostraron que los ratones sin BRCA-1 tienen una expresión disminuida de la proteína MAD2 del punto de control del huso clave. [70] Para otros cánceres, se requiere más trabajo para identificar las causas de la aneuploidía.
Otros genes no asociados tradicionalmente con el SAC en el cáncer
Claramente, las variaciones en los niveles fisiológicos de estas proteínas (como Mad2 o BubR1) están asociadas con aneuploidía y tumorigénesis, y esto se ha demostrado usando modelos animales . [71] [72] Sin embargo, estudios recientes indican que lo que parece suceder es un escenario más complicado: la aneuploidía generaría una alta incidencia de tumorigénesis solo cuando se producen alteraciones en los niveles de componentes específicos del punto de control mitótico (ya sea reducción o sobreexpresión) en los tejidos. también induciendo otros defectos capaces de predisponerlos a tumores. [73] Es decir, defectos como un aumento en el daño del ADN, reordenamientos cromosómicos y / o una menor incidencia de muerte celular. Para algunos componentes de puntos de control mitóticos, se sabe que están implicados en funciones fuera de la mitosis: importación nuclear (Mad1), represión transcripcional (Bub3) y muerte celular, respuesta al daño del ADN, envejecimiento y megacariopoyesis para BubR1. Todo esto apoya la conclusión de que el aumento de la tumorigénesis está asociado con defectos distintos de la aneuploidía sola. [73]
Las mutaciones asociadas al cáncer que afectan a genes de puntos de control conocidos como BUB1 o BUBR1 son en realidad raras. Sin embargo, varias proteínas implicadas en el cáncer tienen intersecciones con las redes de ensamblaje del huso. Los supresores de tumores clave como p53 también juegan un papel en el punto de control del huso. La ausencia de p53, el gen mutado con más frecuencia en el cáncer humano, tiene un efecto importante en los reguladores del punto de control del ciclo celular y se ha demostrado que actúa en el punto de control G1 en el pasado, pero ahora parece ser importante en la regulación del punto de control del huso. [74] Otro aspecto clave del cáncer es la inhibición de la muerte celular o la apoptosis . Survivina , un miembro de la familia de los inhibidores de la apoptosis (IAP), se localiza en grupos en los microtúbulos del huso mitótico cerca de los centrosomas y en los cinetocoros de los cromosomas en metafase. La survivina no solo inhibe la apoptosis para promover la tumorigénesis, sino que se la ha implicado (a través de ratones knockout experimentales) como un importante regulador de la segregación cromosómica y de la mitosis en etapa tardía similar a su papel en organismos más primitivos. [75]
Es probable que otros aspectos del punto de control del ensamblaje del huso, como la unión del cinetocoro, la función de los microtúbulos y la cohesión de las cromátidas hermanas, también sean defectuosos y causen aneuploidía. Se ha observado que las células cancerosas se dividen en múltiples direcciones evadiendo el punto de control del ensamblaje del huso, lo que da como resultado mitosis multipolares. [76] La transición multipolar metafase-anafase ocurre a través de un ciclo de separasa incompleto que resulta en eventos frecuentes de no disyunción que amplifican la aneuploidía en las células cancerosas.
Terapias contra el cáncer de SAC
Los avances en este campo han llevado a la introducción del desarrollo de algunas terapias dirigidas a los defectos del ensamblaje del huso. Los tratamientos más antiguos, como los alcaloides de la vinca y los taxanos, se dirigen a los microtúbulos que acompañan a la formación del huso mitótico a través de la interrupción de la dinámica de los microtúbulos que involucran al SAC deteniendo la célula y finalmente conduciendo a su muerte. [77] Tanto el taxol como el docetaxel todavía se utilizan en el tratamiento del cáncer de mama, el cáncer de ovario y otros tipos de cáncer epitelial. Sin embargo, estos tratamientos a menudo se caracterizan por altas tasas de efectos secundarios y resistencia a los medicamentos.
También se persiguen otros objetivos dentro de la red de reguladores que influyen en la SAC; El gran interés se ha desplazado hacia las proteínas quinasa Aurora . [78] El gen de la quinasa Aurora A, cuando se amplifica, actúa como un oncogén que anula el SAC, lo que da lugar al inicio anormal de la anafase y la aneuploidía posterior y también a la resistencia al TAXOL. [79] Curiosamente, un inhibidor de molécula pequeña de Aurora A ha mostrado efectos antitumorales en un modelo in vivo, lo que sugiere que este podría ser un buen objetivo para un mayor desarrollo clínico. [80] Los inhibidores de Aurora B , que también se encuentran en desarrollo clínico, conducen a un cinetocoro anormal en la unión de los microtúbulos y también anulan el punto de control mitótico. [78] Survivin es también un objetivo molecular atractivo para el desarrollo terapéutico clínico, ya que actúa como un nodo principal en una multitud de vías, una de las cuales es la formación de huso y el control de puntos de control. [81] Incluso otros enfoques han incluido una mirada a la inhibición de proteínas motoras mitóticas como KSP. Estos inhibidores, que han entrado recientemente en ensayos clínicos, provocan un paro mitótico y, al activar el punto de control del ensamblaje del huso, inducen la apoptosis. [82] [3]
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Otras lecturas
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- Wang X, Babu JR, Harden JM, Jablonski SA, Gazi MH, Lingle WL, de Groen PC, Yen TJ, van Deursen JM (julio de 2001). "La proteína del punto de control mitótico hBUB3 y el factor de exportación de ARNm hRAE1 interactúan con las proteínas que contienen la secuencia de unión a GLE2p (GLEBS)" . La Revista de Química Biológica . 276 (28): 26559–67. doi : 10.1074 / jbc.M101083200 . PMID 11352911 .
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enlaces externos
- El laboratorio de Ted Salmon: películas de división de células. [1]
- Laboratorio de Andrea Musacchio: esquemas de puntos de control de husillo. [2]
- http://www.uniprot.org/uniprot/O60566