La purificación por afinidad en tándem ( TAP ) es una técnica de purificación basada en inmunoprecipitación para estudiar las interacciones proteína-proteína . El objetivo es extraer de una célula solo la proteína de interés, en complejo con cualquier otra proteína con la que interactúe. TAP utiliza dos tipos de perlas de agarosa que se unen a la proteína de interés y que pueden separarse del lisado celular mediante centrifugación, sin perturbar, desnaturalizar o contaminar los complejos involucrados. Para permitir que la proteína de interés se una a las perlas, se etiqueta con una pieza diseñada, la etiqueta TAP.
El método TAP original implica la fusión de la etiqueta TAP al extremo C-terminal de la proteína en estudio. La etiqueta TAP consta de péptido de unión a calmodulina (CBP) del N-terminal, seguido de un sitio de escisión de proteasa TEV y dos dominios de proteína A , que se unen estrechamente a IgG (lo que hace que una etiqueta TAP sea un tipo de etiqueta epítopo ).
Se han propuesto muchas otras combinaciones de etiqueta / perla / eluyente desde que se publicó por primera vez el principio TAP.
Etiquetas variantes
Esta etiqueta también se conoce como etiqueta TAP C-terminal porque también está disponible una versión N-terminal . Sin embargo, el método que se describirá asume el uso de una etiqueta C-terminal, aunque el principio detrás del método sigue siendo el mismo.
Historia
El marcado TAP fue inventado por un equipo de investigación que trabajaba en el Laboratorio Europeo de Biología Molecular a finales de la década de 1990 (Rigaut et al., 1999, [1] Puig et al., 2001 [2] ) y propuesto como una nueva herramienta para la exploración de proteomas. El equipo lo utilizó para caracterizar varios complejos de proteínas (Rigaut et al., 1999, [1] Caspary et al. 1999, [3] Bouveret et al., 2000, [4] Puig et al., 2001 [2] ). La primera aplicación a gran escala de esta técnica fue en 2002, en la que el equipo de investigación trabajó en colaboración con científicos de la empresa de proteómica Cellzome para desarrollar un mapa visual de la interacción de más de 230 complejos de múltiples proteínas en una célula de levadura de forma sistemática etiquetar la etiqueta TAP a cada proteína. El primer informe exitoso sobre el uso de la tecnología de etiquetas TAP en plantas se produjo en 2004 (Rohila et al., 2004, [5] )
Proceso
Existen algunos métodos en los que la proteína de fusión se puede introducir en las células huésped. Si el hospedador es una levadura , entonces uno de los métodos puede ser el uso de plásmidos que eventualmente traducirán la proteína de fusión dentro del hospedador. Cualquiera que sea el método que se esté utilizando, es preferible mantener la expresión de la proteína de fusión lo más cerca posible de su nivel natural. Una vez que la proteína de fusión se traduce dentro del huésped, interactuará con otras proteínas, idealmente de una manera que no se vea afectada por la etiqueta TAP.
Posteriormente, la proteína etiquetada (con sus socios de unión) se recupera mediante un proceso de selección por afinidad .
El primer tipo de microesfera que se agrega se recubre con inmunoglobulina G , que se une al extremo más externo de la etiqueta TAP. Las perlas, con las proteínas de interés, se separan del lisado mediante centrifugación. Luego, las proteínas son liberadas de las perlas por una enzima ( proteasa TEV ) que rompe la etiqueta en el sitio de escisión TEV en el medio.
Después de este primer paso de purificación, se agrega un segundo tipo de perla (recubierta con calmodulina ) a las proteínas liberadas que se une de manera reversible a la pieza restante de la etiqueta TAP que aún se encuentra en las proteínas. Las perlas se separan nuevamente por centrifugación, eliminando además los contaminantes, así como la proteasa TEV. [2] Finalmente, las perlas son liberadas por EGTA , dejando atrás el eluido nativo que contiene solo la proteína de interés, sus proteínas asociadas unidas y la pieza restante de CBP de la etiqueta TAP.
A continuación, el eluido nativo puede analizarse mediante electroforesis en gel y espectrometría de masas para identificar los socios de unión de la proteína.
Ventajas
Una ventaja de este método es que puede haber una determinación real de proteínas asociadas cuantitativamente in vivo sin conocimiento previo de la composición compleja. También es sencillo de ejecutar y, a menudo, proporciona un alto rendimiento. [2] Uno de los obstáculos para estudiar la interacción proteína-proteína es la contaminación de la proteína diana, especialmente cuando no tenemos ningún conocimiento previo de ella. TAP ofrece un medio eficaz y altamente específico para purificar la proteína objetivo. Después de 2 purificaciones por afinidad sucesivas, la posibilidad de que se retengan contaminantes en el eluato se reduce significativamente.
Desventajas
Sin embargo, también existe la posibilidad de que una etiqueta agregada a una proteína pueda ocultar la unión de la nueva proteína a sus socios interactuantes. Además, la etiqueta también puede afectar los niveles de expresión de proteínas. Por otro lado, la etiqueta también puede no estar suficientemente expuesta a las perlas de afinidad, sesgando así los resultados.
También puede existir la posibilidad de una escisión de las proteínas por la proteasa TEV , aunque es poco probable que esto sea frecuente dada la alta especificidad de la proteasa TEV. [6]
Idoneidad
Como este método implica al menos 2 rondas de lavado, puede no ser adecuado para seleccionar interacciones proteicas transitorias , a diferencia del método de dos híbridos de levadura o la reticulación in vivo con análogos de aminoácidos fotorreactivos . Sin embargo, es un buen método para probar interacciones proteicas estables y permite varios grados de investigación controlando el número de veces que se purifica el complejo proteico. [ cita requerida ]
Aplicaciones
En 2002, la etiqueta TAP se utilizó por primera vez con espectrometría de masas en un enfoque a gran escala para analizar sistemáticamente la proteómica de la levadura mediante la caracterización de complejos multiproteicos. [7] El estudio reveló 491 complejos, 257 de ellos completamente nuevos. El resto estaba familiarizado con otras investigaciones, pero ahora se descubrió que prácticamente todos tenían componentes nuevos. Elaboraron un mapa que relacionaba todos los componentes de las proteínas funcionalmente en una red compleja.
Muchos otros análisis proteómicos también implican el uso de etiqueta TAP. Una investigación de EMBO (Dziembowski, 2004) identificó un nuevo complejo necesario para la retención y el empalme de pre-ARNm nuclear. Han purificado un complejo trimérico novedoso compuesto por otras 3 subunidades (Snu17p, Bud13p y Pml1p) y han descubierto que estas subunidades no son esenciales para la viabilidad, sino necesarias para un empalme eficiente (eliminación de intrones) de pre-ARNm. En 2006, Fleischer et al. proteínas identificadas sistemáticamente asociadas con complejos ribosomales eucariotas. [8] Usaron pantallas proteómicas de espectrometría de masas multifacéticas para identificar complejos ribosomales de levadura y luego usaron el etiquetado TAP para unir funcionalmente todas estas proteínas.
Otras combinaciones de epítopo-etiqueta
El principio de purificación por afinidad en tándem de complejos multiproteicos no se limita a la combinación de etiquetas CBP y Proteína A utilizadas en el trabajo original de Rigaut et al. (1999). Por ejemplo, la combinación de etiquetas FLAG y HA ha sido utilizada desde 2000 por el grupo de Nakatani [9] [10] para purificar numerosos complejos de proteínas de células de mamíferos. Se han propuesto muchas otras combinaciones de etiquetas desde que se publicó el principio TAP.
Referencias
- ^ a b Rigaut G, et al. (1999). "Un método genérico de purificación de proteínas para la caracterización de complejos de proteínas y la exploración de proteomas". Biotecnología de la naturaleza . 17 (10): 1030–1032. doi : 10.1038 / 13732 . PMID 10504710 .
- ^ a b c d Puig, O .; et al. (2001). "El método de purificación de afinidad en tándem (TAP): un procedimiento general de purificación del complejo de proteínas". Métodos . 24 (3): 218-229. doi : 10.1006 / meth.2001.1183 . PMID 11403571 .
- ^ Caspary F y col. (1999). "La purificación parcial de la levadura U2 snRNP revela un nuevo factor de empalme de pre-ARNm de levadura requerido para el ensamblaje previo al espliceosoma" . El diario EMBO . 18 (12): 3463–3474. doi : 10.1093 / emboj / 18.12.3463 . PMC 1171425 . PMID 10369685 .
- ^ Bouveret E y col. (2000). "Un complejo proteico similar a Sm que participa en la degradación del ARNm" . El diario EMBO . 19 (7): 1661–1671. doi : 10.1093 / emboj / 19.7.1661 . PMC 310234 . PMID 10747033 .
- ^ Rohila, Jai S .; Chen, Mei; Cerny, Ronald; Fromm, Michael E. (febrero de 2004). "Etiqueta de purificación de afinidad en tándem mejorada y métodos para el aislamiento de heterocomplejos de proteínas de plantas" . The Plant Journal . 38 (1): 172–181. doi : 10.1111 / j.1365-313X.2004.02031.x . PMID 15053770 .
- ^ Dougherty, WG, SM Cary y TD Parks (1989). "Análisis genético molecular de un sitio de escisión de poliproteínas de virus de plantas: un modelo". Virología . 171 (2): 356–364. doi : 10.1016 / 0042-6822 (89) 90603-X . PMID 2669323 .CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
- ^ Organización funcional del proteoma de levadura mediante análisis sistemático de complejos proteicos , Gavin AC et al. Nature 415, 141-147 (10 de enero de 2002) | doi : 10.1038 / 415141a ; Recibido el 15 de agosto de 2001; Aceptado el 25 de octubre de 2001
- ^ Identificación sistemática y pantallas funcionales de proteínas no caracterizadas asociadas con complejos ribosomales eucariotas , doi: 10.1101 / gad.1422006, Genes Dev. 2006. 20: 1294-1307
- ^ Ikura T y col. "Participación del complejo acetilasa de histona TIP60 en la reparación del ADN y la apoptosis". Celular . 2,000 102 (4): 463-73. [1]
- ^ Nakatani Y, Ogryzko V. "Purificación por inmunoafinidad de complejos de proteínas de mamíferos". Métodos Enzymol . 2003; 370 : 430-44. [2]