Los cromosomas equilibradores (o simplemente equilibradores ) son un tipo de cromosoma modificado genéticamente que se utiliza en biología de laboratorio para el mantenimiento de mutaciones letales (o estériles) recesivas dentro de los organismos vivos sin interferencia de la selección natural . Dado que tales mutaciones son viables solo en heterocigotos , no pueden mantenerse de manera estable a lo largo de generaciones sucesivas y, por lo tanto, conducen continuamente a la producción de organismos de tipo salvaje , que se pueden prevenir reemplazando el cromosoma de tipo salvaje homólogo con un equilibrador. En esta capacidad, los equilibradores son cruciales para la investigación genética en organismos modelo comoDrosophila melanogaster , la mosca común de la fruta, cuyas existencias no se pueden archivar (por ejemplo, congeladas). También pueden ser utilizados en genética directa pantallas para identificar específicamente mutaciones letales (o estériles) recesivos. Por esa razón, los equilibradores también se utilizan en otros organismos modelo, sobre todo el gusano nematodo Caenorhabditis elegans y el ratón. [1]
Los cromosomas equilibradores típicos están diseñados para (1) portar mutaciones letales recesivas ellos mismos, eliminando homocigotos que no portan la mutación deseada; (2) suprimir la recombinación meiótica con sus homólogos, lo que evita la creación de novo de cromosomas de tipo salvaje; y (3) portan marcadores genéticos dominantes , que pueden ayudar a identificar recombinantes raros y son útiles para fines de detección.
Historia
Los cromosomas equilibradores fueron utilizados por primera vez en la mosca de la fruta por Hermann Muller , quien fue pionero en el uso de la radiación para la mutagénesis de organismos . [2]
En el uso moderno de los cromosomas equilibradores, las mutaciones aleatorias se inducen primero exponiendo organismos vivos con cromosomas normales a sustancias que causan daños en el ADN ; en moscas y nematodos, esto suele ocurrir al alimentar a las larvas con metanosulfonato de etilo (EMS). Las larvas dañadas por el ADN (o los adultos en los que se desarrollan) se examinan para detectar mutaciones. Cuando se observa un fenotipo de interés, la línea que expresa la mutación se cruza con otra línea que contiene cromosomas equilibradores para mantener su linaje. [3] En un caso, se utilizaron equilibradores para seleccionar genéticamente una población de Caenorhabditis elegans . En este momento, los científicos ya se habían dado cuenta de los beneficios de poder seleccionar genéticamente poblaciones de organismos para su estudio genético. Igualmente importante, también se dieron cuenta de que podían limitar el cruzamiento en estas poblaciones y darles composiciones genéticas muy consistentes. [4]
Desde entonces, el uso de cromosomas equilibradores se ha convertido en un método bien conocido y ampliamente utilizado para el cribado genético de organismos modelo. Incluso se están utilizando para investigar el papel del empaquetamiento de heterocromatina y el efecto que tiene sobre los genes, [5] así como estudios de los efectos que tienen los telómeros sobre el silenciamiento de genes . [6]
Mecanismo
En los organismos diploides , las mutaciones sin fenotipos recesivos letales (o estériles) pueden simplemente reproducirse en homocigosis y mantenerse estable e indefinidamente cruzando homocigotos. Sin embargo, los homocigotos para mutaciones letales recesivas no son por definición viables, porque la presencia del alelo letal recesivo en ambos homólogos cromosómicos hace que el organismo muera temprano en el desarrollo; un organismo que es homocigoto para una mutación recesiva que causa esterilidad produce esencialmente el mismo resultado (es decir, su material genético no puede transmitirse a la progenie, incluso si el propio individuo estéril sobrevive hasta la madurez). Este problema obliga a los genetistas que desean estudiar mutaciones letales / estériles recesivas a mantener la mutación en organismos heterocigotos en su lugar (en los que un cromosoma que contiene una mutación letal / estéril recesiva se complementa con un homólogo que funciona como de tipo salvaje en el mismo locus, lo que permite que la organismo para sobrevivir y reproducirse más o menos normalmente).
Los cruces entre heterocigotos producen organismos de tipo salvaje además de heterocigotos y homocigotos no viables. Para mantener una línea puramente heterocigótica, se debe identificar la descendencia de tipo salvaje y evitar el apareamiento. Esto puede ser prohibitivamente intensivo en recursos, especialmente si el objetivo es el mantenimiento a largo plazo de la mutación recesiva.
La sustitución de un cromosoma equilibrador por el homólogo de tipo salvaje del cromosoma que lleva la mutación recesiva evita el establecimiento de organismos de tipo salvaje de diversas formas. En primer lugar, un equilibrador porta su propia mutación letal recesiva independiente, lo que hace que el organismo no sea viable si se heredan dos copias del equilibrador (es decir, ninguna copia de la mutación deseada). Sin embargo, la recombinación entre el equilibrador y el homólogo que contiene el alelo mutado también puede resultar en la creación de novo de un cromosoma de tipo salvaje. Para suprimir la recombinación, los equilibradores suelen albergar múltiples inversiones cromosómicas anidadas, de modo que se interrumpe la sinapsis entre los cromosomas homólogos. [7] Si se produce un cruce, a menudo está desequilibrado, y cada cromátida resultante carece de algunos genes y lleva dos copias de otros. El proceso también puede conducir a cromosomas dicéntricos o acéntricos (cromosomas con dos centrómeros o sin centrómero), que son inherentemente inestables y generalmente terminan rompiendo y mutando o perdiéndose durante la mitosis posterior. Es muy probable que todos estos resultados sean letales.
Por último, los cromosomas equilibradores portan marcadores genéticos dominantes , como los genes de la proteína verde fluorescente o las enzimas que producen pigmentos visualmente llamativos, que permiten a los investigadores reconocer fácilmente los organismos que portan el equilibrador. [8] En el improbable caso de una recombinación viable, el marcador puede perderse, alertando así a los investigadores sobre el evento.
Es importante destacar que la supresión de la recombinación por inversiones anidadas solo ocurre en los intervalos invertidos, mientras que otras regiones (generalmente regiones peri-centroméricas y sub-teloméricas) son libres de recombinarse. Asimismo, si la mutación deseada está en el mismo locus que la mutación letal recesiva del equilibrador (es decir, está en un fuerte desequilibrio de ligamiento con ella), la recombinación que da como resultado un cromosoma de tipo salvaje es muy poco probable, independientemente de las inversiones supresoras de recombinación.
Además de simplemente mantener una mutación letal (o estéril) recesiva aislada, los cromosomas equilibradores también son útiles en cribados genéticos avanzados para identificar tales mutaciones. En tales pantallas, los organismos mutagenizados aleatoriamente que llevan un equilibrador se cruzan entre sí. Los descendientes que portan el equilibrador, identificados por el marcador dominante, pueden cruzarse con compañeros de camada. Cualquier cruce de este tipo que no produzca animales con marcadores negativos es probablemente el resultado de una mutación letal recesiva en el cromosoma no equilibrador. Por supuesto, solo el intervalo genómico cubierto por las inversiones en el equilibrador se puede cribar de esta manera, perdiéndose mutaciones letales recesivas en otros intervalos y en otros cromosomas.
Convención de nomenclatura en Drosophila
Los cromosomas equilibradores reciben el nombre del cromosoma que sirven para estabilizar y del marcador genético o fenotípico que lleva el equilibrador. [9] El nombre de los cromosomas equilibradores en D. melanogaster se ha estandarizado de la siguiente manera: la primera letra del nombre del cromosoma representa el número del cromosoma que estabiliza. F representa el primer cromosoma, S el segundo y T el tercero. El cuarto cromosoma pequeño no se recombina y, por lo tanto, no requiere equilibrio. Esta letra es seguida por una M para "multiplicar invertida". La M va seguida de un número para distinguir los equilibradores del mismo cromosoma. Además, el marcador o marcadores genéticos dentro del equilibrador se enumeran después del nombre y separados por una coma. Generalmente, las mutaciones con rasgos fenotípicos dominantes fácilmente observables que a menudo son homocigotos letales se utilizan para asegurar que toda la progenie sea heterocigótica. Por ejemplo, el equilibrador TM3, Sb de uso común estabiliza el tercer cromosoma y lleva un gen Sb mutante ("rastrojo") como marcador dominante. Todas las moscas que contienen el equilibrador TM3, Sb tendrán pelos cortos o sin barba en la parte posterior del abdomen, que se pueden ver fácilmente cuando se observan a través de un microscopio. El 3 distingue a este equilibrador de otros equilibradores del tercer cromosoma como TM1 y TM2 .
Se dice que una línea es "doble equilibrada" si es heterocigótica para dos cromosomas equilibradores diferentes (por ejemplo, TM6, Tb / TM3, Ser ) en un cromosoma y un mutante homocigoto-letal, heterocigoto-visible en el otro, salvaje. -tipo cromosoma (por ejemplo, D / TM3, Ser ). La mayoría de los cromosomas equilibradores también llevan un alelo recesivo, como la mutación "ébano", que solo se manifiesta en estas cepas con dos cromosomas equilibradores. Estas poblaciones se utilizan a menudo para proporcionar fuentes de rasgos fácilmente rastreables cuando se reproducen dos líneas diferentes juntas, de modo que se pueda seleccionar la progenie correcta de cada cruce. Las poblaciones con doble equilibrio en el segundo y tercer cromosomas de Drosophila están ampliamente disponibles en los depósitos de poblaciones de moscas.
Contribuciones científicas importantes utilizando cromosomas equilibradores
Los cromosomas equilibradores brindan a los genetistas un método confiable para detectar genéticamente organismos en busca de una mutación específica y mantener esa mutación de manera constante en las generaciones posteriores. Una nueva técnica que utiliza cromosomas equilibradores se explora en el artículo "La técnica autosómica Flp-Dfs para generar mosaicos de la línea germinal en Drosophila Melanogaster" , que mostró por primera vez que es posible detectar una mutación recesiva que solo muestra un fenotipo cuando es homocigota. . Utilizando métodos de cromosomas equilibradores antiguos, el cribado genético solo permitió la selección de mutaciones dominantes heterocigotas. Este experimento utiliza el cribado clonal para detectar individuos homocigotos y mantenerlos en una línea constante. [10] Lo lograron utilizando el gen de recombinasa FLP , aislado de levadura, que causa grandes inversiones cromosómicas . Mediante ensayo y error, encontraron que los cromosomas podían recombinarse de modo que cada uno tuviera la mutación recesiva, mientras que la otra mitad contenía la mitad de un cromosoma equilibrador con un marcador físico y un recesivo letal. El otro homólogo no contenía el letal recesivo en las líneas que sobrevivieron. La figura uno en el papel ilustra la pantalla. Esta nueva técnica permitió el cribado recesivo en el 95% del genoma de Drosophila . También mejoró enormemente los rendimientos en mutaciones de la línea germinal. [10]
Otro artículo publicado que empleó el uso de cromosomas equilibradores es "Inhibición de la interferencia de ARN y modulación de la expresión de elementos transponibles por muerte celular en Drosophila" . Este artículo demuestra el poder de los cromosomas equilibradores y lo que se puede lograr con líneas genéticamente estables. Se estableció una línea que presentaba niveles bajos de muerte celular y se denominó EGFPir hs-hid. Cuando se analizaron los niveles de ARNi , los autores encontraron resultados interesantes en las células que experimentan bajos niveles de muerte celular y las células circundantes en el tejido. Descubrieron que estas células apagarían su mecanismo de ARNi al mantener el ARN en un estado bicatenario; es decir, si el ARN permanece en un estado bicatenario, entonces el mecanismo de silenciamiento génico del ARNi se desactiva de manera efectiva.
Los autores especularon que esta respuesta era una tendencia evolutiva hacia una respuesta inmune redundante contra los virus de ARN. Si una célula ya está sufriendo la muerte celular para intentar detener la propagación de un virus, entonces la respuesta inmune del ARNi ha sido ineficaz. Esto provoca otra respuesta inmune que intenta detener el virus, que se une al ARN bicatenario y lo mantiene bicatenario para que no pueda transcribirse en proteínas virales. Se desconoce el mecanismo preciso por el cual se mantiene el ARN bicatenario. [11]
Referencias
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- ^ Hermann Muller inventó el cromosoma equilibrador
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