La capacitación es el penúltimo [1] paso en la maduración de los espermatozoides de mamíferos y es necesaria para hacerlos competentes para fertilizar un ovocito . [2] Este paso es un evento bioquímico; los espermatozoides se mueven normalmente y parecen maduros antes de la capacitación. In vivo , la capacitación se produce después de la eyaculación , cuando los espermatozoides abandonan la vagina y entran en el tracto reproductor femenino superior . El útero ayuda en los pasos de la capacitación secretando albúmina de unión a esteroles , lipoproteínas y proteolíticas y enzimas glicosidásicas como la heparina.
Para los fines de la fertilización in vitro, la capacitación se produce mediante la incubación de espermatozoides que se han sometido a la eyaculación o se han extraído del epidídimo e incubados en un medio definido durante varias horas. Existen diferentes técnicas para realizar el paso de capacitación: lavado simple, migración (swim-up), gradientes de densidad y filtrado. El objetivo es aislar tantos espermatozoides móviles como sea posible y eliminar espermatozoides inmóviles o muertos. Después de la capacitación in vivo o in vitro, los espermatozoides deben pasar por el paso de maduración final, la activación, que implica la reacción del acrosoma .
Los espermatozoides no mamíferos no requieren este paso de capacitación y están listos para fertilizar un ovocito inmediatamente después de su liberación del macho.
Función y mecanismo
La capacitación tiene dos efectos: desestabilización de la membrana acrosómica de la cabeza del espermatozoide que le permite penetrar en la capa externa del óvulo, y cambios químicos en la cola que permiten una mayor movilidad en el espermatozoide. [3] Los cambios se facilitan mediante la eliminación de esteroles (por ejemplo, colesterol ) y glucoproteínas epididimarias / seminales unidas de forma no covalente . El resultado es una membrana más fluida con una mayor permeabilidad al ion Ca 2+ .
Un influjo de Ca 2+ produce un aumento de los niveles de AMPc intracelular y, por tanto, un aumento de la motilidad. La hiperactivación coincide con el inicio de la capacitación y es el resultado del aumento de los niveles de Ca 2+ . Tiene un efecto estimulante sinérgico con la adenosina que aumenta la actividad de la adenilil ciclasa en los espermatozoides. [ cita requerida ]
El péptido tripéptido promotor de la fertilización (FPP) es esencial para controlar la capacidad. El FPP se produce en la glándula prostática como componente del líquido seminal. El FPP entra en contacto con los espermatozoides durante la eyaculación, ya que el esperma y el líquido seminal se mezclan. Los altos niveles de FPP activo evitan la capacitación. Después de la eyaculación, la concentración de FPP cae en el tracto reproductivo femenino. [ cita requerida ]
Inducción
Debido a que las tecnologías de reproducción asistida , o ART, como la fertilización in vitro (FIV) o la inseminación intrauterina (IIU) requieren la inducción de la capacitación de los espermatozoides fuera de los parámetros biológicos normales, se han desarrollado numerosos métodos para inducir este proceso en los espermatozoides de mamíferos. Los espermatozoides se recolectan mediante eyaculación o se recolectan del epidídimo caudal y se dejan licuar a temperatura ambiente. Luego, se puede inducir la capacitación agregando medios diseñados para imitar la composición electrolítica de las trompas de Falopio , donde ocurre la fertilización. Estos medios varían entre especies, pero están basados en solución salina y contienen sustratos energéticos como lactato, piruvato y posiblemente glucosa. Se requiere un aceptor de colesterol para facilitar la eliminación del colesterol de la membrana del espermatozoide, que siempre es albúmina. La albúmina de suero bovino se usa típicamente para estudios en animales in vitro , y la albúmina de suero humano (HSA) se usa en la inducción de capacitación de esperma humano.
El bicarbonato es un componente vital de los medios que inducen la capacitación, ya que se co-transporta al citosol donde activa la adenilil ciclasa soluble (sAC) y actúa como un tampón de pH necesario para evitar la disminución del pH en el cultivo, una adición necesaria. cuando la incubación de las células en 5% de CO 2 como se usa generalmente aunque no se requiere. Se agrega cloruro de calcio para facilitar la entrada a través de los cationes de calcio. [4] [5] En modelos animales, el medio de piruvato de lactato de albúmina de Tyrode (TALP) se usa típicamente como base, que contiene cada uno de estos componentes. En humanos, se usa fluido tubárico humano (HTF).
Estos medios pueden complementarse con otros productos químicos para inducir la motilidad espermática hiperactivada y / o la reacción acrosómica. Para la fertilización animal in vitro, la cafeína a una concentración de 5 mM es un fuerte inductor de la capacitación espermática in vitro . [6] [7] Los ionóforos de calcio también son ideales para inducir la capacitación. [7] La adición de heparina al medio inductor de capacitación imita la secreción de gicosaminoglicanos similares a la heparina (GAG) cerca del ovocito e inicia la reacción del acrosoma. Este efecto se magnifica cuando se agrega lisofosfatidilcolina (LC) junto con heparina. [8] Se ha demostrado que las catecolaminas como la noradrenalina en concentraciones bajas ayudan en la inducción de la reacción acrosómica. [9]
Técnicas de capacitación in vitro
Los métodos tradicionales para realizar la capacitación in vitro son:
- Lavado simple: este método solo elimina el plasma seminal, no selecciona los mejores espermatozoides. La muestra se centrifuga y luego se elimina el sobrenadante. Se utiliza en muestras de oligozoospermia severa, criptozoospermia o biopsia de testículo. También se realiza antes que otras técnicas de capacitación.
- Migración (swim-up). En primer lugar, tiene lugar la centrifugación y se elimina el plasma seminal. Luego, se agregan 0.5-1 ml de medio de cultivo en la parte superior y luego del período de incubación a 37 ° C, los mejores espermatozoides móviles ascenderán desde la parte inferior hacia la parte superior del tubo (los espermatozoides sanos van al medio de cultivo). Para obtener la fracción rica en espermatozoides, se recolecta la capa superior. Todavía se usa ampliamente y es útil en normozoospermia. Permite obtener fracciones con más del 90% de espermatozoides PR.
- Gradientes de densidad. En esta técnica, un tubo se llena con capas de líquidos de diferentes densidades y se coloca semen en la capa superior. Luego, el tubo pasa por una centrifugación para filtrar los desechos celulares y las células inmóviles. Después de la centrifugación, los espermatozoides sanos se encuentran en la capa inferior del líquido en el tubo, mientras que los desechos y los espermatozoides inmóviles se encuentran en las capas superiores. Este procedimiento dura aproximadamente 60 minutos y está especialmente indicado en oligozoospermia, astenozoospermia y abundantes muestras de detritos. Al final, todas las células llegarán al fondo, pero las que tengan más motilidad llegarán antes. Este procedimiento a menudo se denomina simplemente "método de Percoll", ya que Percoll se usaba con frecuencia como medio de densidad, pero ahora se usan otros medios de densidad. [10]
- Filtración. Consiste en un filtro que no deja pasar todos los espermatozoides. Hoy en día se usa menos y solo los espermatozoides con mejor motilidad pasarán por el filtro.
Sin embargo, hoy en día existen nuevas técnicas que superan a estas. Por ejemplo, tenemos PICSI, MACS o chips microfluídicos.
Medición
Se han desarrollado numerosos métodos para evaluar el grado en que los espermatozoides experimentan una capacitación in vitro. El análisis de esperma asistido por computadora (CASA) se desarrolló en la década de 1980 para medir la cinemática de los espermatozoides. [11] CASA utiliza microscopía de contraste de fase combinada con software de seguimiento de espermatozoides para analizar los parámetros de motilidad de los espermatozoides. [11] Se ha demostrado que ciertos parámetros como la velocidad curvilínea (VCL), la velocidad en línea recta (VSL), la velocidad de trayectoria promedio (VAP) y la amplitud del desplazamiento lateral de la cabeza (ALH) se correlacionan positivamente con la adquisición de la competencia de fertilización y por tanto, se utilizan para identificar la motilidad de los espermatozoides hiperactivos. [12]
Si bien las mediciones de motilidad son críticas para identificar la presencia de motilidad hiperactiva, se han desarrollado métodos adicionales para identificar la aparición de la reacción acrosómica. Un método simple utiliza azul brillante de Coomassie G250 para teñir las células, proporcionando evidencia visual de acrosomas intactos o reaccionados. [13] Las técnicas más avanzadas emplean métodos de microscopía electrónica o fluorescente . La aglutinina de maní conjugada con fluoresceína (FITC-PNA) o la aglutinina de Pisum sativum (FITC-PSA) se pueden usar para marcar con fluorescencia el acrosoma de los espermatozoides, que luego se pueden usar para evaluar el estado del acrosoma usando un microscopio fluorescente . [14] [15] [16]
Descubrimiento
El descubrimiento de este proceso fue informado de forma independiente en 1951 por Min Chueh Chang [17] y Colin Russell Austin . [18] [19]
Ver también
- Reacción cortical
- Reacción del acrosoma
Referencias
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Otras lecturas
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enlaces externos
- Sperm + Capacitation en la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU. Encabezados de temas médicos (MeSH)