La tecnología de matrices de proteínas sin células produce micromatrices de proteínas mediante la síntesis in vitro de las proteínas diana a partir de sus plantillas de ADN . Este método de síntesis de micromatrices de proteínas supera los muchos obstáculos y desafíos que enfrentan los métodos tradicionales de producción de matrices de proteínas [1] que han impedido la adopción generalizada de micromatrices de proteínas en la proteómica . Las matrices de proteínas fabricadas con esta tecnología se pueden utilizar para probar las interacciones proteína-proteína , así como las interacciones de proteínas con otras moléculas celulares como el ADN y los lípidos. Otras aplicaciones incluyen ensayos de inhibición enzimática y exámenes de especificidad de anticuerpos.
Resumen / antecedentes
El gran éxito de los microarrays de ADN ha generado mucho entusiasmo por los microarrays de proteínas. Sin embargo, los microarrays de proteínas no han despegado como se esperaba, incluso con las herramientas necesarias y los conocimientos técnicos de los microarrays de ADN en su lugar y listos para la adaptación. Una de las principales razones es que los microarrays de proteínas son mucho más laboriosos y técnicamente difíciles de construir que los microarrays de ADN.
Los métodos tradicionales de producción de matrices de proteínas requieren la expresión in vivo separada de cientos o miles de proteínas, seguida de una purificación e inmovilización separadas de las proteínas en una superficie sólida. La tecnología de matrices de proteínas sin células intenta simplificar la construcción de micromatrices de proteínas sin pasar por alto la necesidad de expresar las proteínas en las células bacterianas y la subsiguiente necesidad de purificarlas. Aprovecha la tecnología de síntesis de proteínas libre de células disponible que ha demostrado que la síntesis de proteínas puede ocurrir sin una célula intacta siempre que se proporcionen extractos de células que contengan la plantilla de ADN, las materias primas de transcripción y traducción y la maquinaria. [2] Las fuentes comunes de extractos celulares utilizados en la tecnología de matriz de proteínas libres de células incluyen germen de trigo , Escherichia coli y reticulocitos de conejo . También se han utilizado extractos de células de otras fuentes tales como hipertermófilos , hibridomas , ovocitos de Xenopus , células de insectos, mamíferos y humanos. [3]
Las proteínas diana se sintetizan in situ en la micromatriz de proteínas, directamente a partir de la plantilla de ADN, saltándose así muchos de los pasos de la producción tradicional de micromatrices de proteínas y las limitaciones técnicas que las acompañan. Más importante aún, la expresión de las proteínas se puede hacer en paralelo, lo que significa que todas las proteínas se pueden expresar juntas en una sola reacción. Esta capacidad de multiplexar la expresión de proteínas es un importante ahorro de tiempo en el proceso de producción.
Métodos de síntesis
Métodos in situ
En el método in situ , la síntesis de proteínas se lleva a cabo en una superficie de matriz de proteínas que está prerrevestida con un reactivo o anticuerpo capturador de proteínas . Una vez que las proteínas recién sintetizadas se liberan del ribosoma , la secuencia etiqueta que también se sintetiza en el extremo N o C de cada proteína naciente se unirá al reactivo de captura o anticuerpo, inmovilizando así las proteínas para formar una matriz. Las etiquetas comúnmente utilizadas incluyen polihistidina (His) 6 y glutatión s-transferasa (GST).
Varios grupos de investigación han desarrollado sus propios métodos, cada uno de los cuales difiere en su enfoque, pero se pueden resumir en 3 grupos principales.
Matriz de proteínas programables de ácidos nucleicos (NAPPA)
NAPPA [4] utiliza una plantilla de ADN que ya ha sido inmovilizada en la misma superficie de captura de proteínas. La plantilla de ADN está biotinilada y se une a la avidina que se recubre previamente sobre la superficie de captura de proteínas. Las proteínas recién sintetizadas que están marcadas con GST se inmovilizan luego junto al ADN molde mediante la unión al anticuerpo de captura anti-GST policlonal adyacente que también se recubre previamente sobre la superficie de captura. El principal inconveniente de este método son los pasos de preparación adicionales y tediosos al comienzo del proceso: (1) la clonación de ADNc en un vector listo para la expresión ; y (2) la necesidad de biotinilar el ADN plasmídico pero no interferir con la transcripción. Además, la matriz de proteínas resultante no es "pura" porque las proteínas están co-localizadas con sus plantillas de ADN y capturan anticuerpos. [3]
Matriz de proteínas in situ (PISA)
A diferencia de NAPPA, PISA [5] evita completamente la inmovilización del ADN ya que la plantilla de ADN se agrega como una molécula libre en la mezcla de reacción. En 2006, otro grupo refinó y miniaturizó este método mediante el uso de la técnica de manchas múltiples para detectar la plantilla de ADN y la mezcla de transcripción y traducción libre de células en una micromatriz de proteínas de alta densidad con hasta 13.000 manchas. [6] Esto fue posible gracias al sistema automatizado utilizado para suministrar de forma precisa y secuencial los reactivos para que la reacción de transcripción / traducción se produzca en una pequeña gota de menos de nanolitros.
Captura de puromicina in situ
Este método es una adaptación de la tecnología de visualización de ARNm . El ADN de la PCR se transcribe primero a ARNm , y luego se hibrida un oligonucleótido de ADN monocatenario modificado con biotina y puromicina en cada extremo con el extremo 3 'del ARNm. A continuación, los ARNm se colocan en un portaobjetos y se inmovilizan mediante la unión de biotina a estreptavidina que se recubre previamente en el portaobjetos. A continuación, se distribuye el extracto celular en el portaobjetos para que tenga lugar la traducción in situ . Cuando el ribosoma alcanza el oligonucleótido hibridado, se detiene e incorpora la molécula de puromicina a la cadena polipeptídica naciente , uniendo así la proteína recién sintetizada a la micromatriz a través del oligonucleótido de ADN. [7] Se obtiene una matriz de proteína pura después de digerir el ARNm con ARNasa . Las manchas de proteína generadas por este método están muy definidas y pueden producirse a una alta densidad.
Formato de matriz de nanopozos
Los formatos de matriz de nanopozos se utilizan para expresar proteínas individuales en recipientes de reacción de pequeño volumen o nanopozos [8] [9] (Figura 4). A veces se prefiere este formato porque evita la necesidad de inmovilizar la proteína diana, lo que podría resultar en la pérdida potencial de actividad de la proteína. La miniaturización de la matriz también conserva la solución y los compuestos preciosos que podrían usarse en los ensayos de detección. Además, las propiedades estructurales de los pozos individuales ayudan a prevenir la contaminación cruzada entre cámaras. En 2012 se publicó un NAPPA mejorado, que utilizaba una matriz de nanopozos para evitar la difusión. Aquí, el ADN se inmovilizó en el pocillo junto con un anticuerpo anti-GST. Luego se añadió la mezcla de expresión libre de células y los pocillos se cerraron con una tapa. Las proteínas nacientes que contienen una etiqueta GST se unieron a la superficie del pozo, lo que permitió una matriz NAPPA con mayor densidad y casi sin contaminación cruzada. [10]
Matriz de ADN a matriz de proteínas (DAPA)
La matriz de ADN a la matriz de proteínas (DAPA) es un método desarrollado en 2007 para producir repetidamente matrices de proteínas "imprimiéndolas" a partir de una única matriz de plantilla de ADN, a pedido [11] (Figura 5). Comienza con el manchado e inmovilización de una serie de plantillas de ADN en un portaobjetos de vidrio. Luego, el portaobjetos se ensambla cara a cara con un segundo portaobjetos prerrecubierto con un reactivo de captura de proteínas, y se coloca una membrana empapada con extracto celular entre los dos portaobjetos para que tenga lugar la transcripción y la traducción. Las proteínas marcadas con his recién sintetizadas se inmovilizan luego en el portaobjetos para formar la matriz. En la publicación en 18 de 20 replicaciones se pudo generar una copia de microarrays de proteínas. Potencialmente, el proceso puede repetirse tantas veces como sea necesario, siempre que el ADN no resulte dañado por las ADNas, la degradación o la abrasión mecánica.
Ventajas
Muchas de las ventajas de la tecnología de matrices de proteínas sin células abordan las limitaciones del sistema de expresión basado en células utilizado en los métodos tradicionales de producción de micromatrices de proteínas.
Rápido y rentable
El método evita la clonación de ADN (con la excepción de NAPPA) y puede convertir rápidamente información genética en proteínas funcionales mediante el uso de ADN de PCR. Los pasos reducidos en la producción y la capacidad de miniaturizar el sistema ahorran en el consumo de reactivos y reducen los costos de producción.
Mejora la disponibilidad de proteínas.
Muchas proteínas, incluidos los anticuerpos, son difíciles de expresar en las células huésped debido a problemas de insolubilidad, enlaces disulfuro o toxicidad de la célula huésped. [1] La matriz de proteínas sin células hace que muchas de estas proteínas estén disponibles para su uso en micromatrices de proteínas.
Permite el almacenamiento a largo plazo
A diferencia del ADN, que es una molécula muy estable, las proteínas son una clase heterogénea de moléculas con diferente estabilidad y propiedades fisicoquímicas. Mantener el plegamiento y la función de las proteínas en un estado inmovilizado durante largos períodos de almacenamiento es un desafío importante para los microarrays de proteínas. Los métodos sin células brindan la opción de obtener rápidamente microarrays de proteínas a pedido, eliminando así cualquier problema asociado con el almacenamiento a largo plazo.
Flexible
El método es compatible con una variedad de plantillas diferentes: productos de PCR, plásmidos y ARNm. Pueden incluirse componentes adicionales durante la síntesis para ajustar el entorno para el plegamiento de proteínas, la formación de enlaces disulfuro, la modificación o la actividad de las proteínas. [3]
Limitación
- La modificación postraduccional de proteínas en proteínas generadas por síntesis de proteínas libres de células [12] sigue siendo limitada en comparación con los métodos tradicionales, [13] y puede que no sea tan biológicamente relevante.
Aplicaciones
Interacciones de proteínas: para detectar interacciones proteína-proteína [4] e interacciones de proteínas con otras moléculas como metabolitos , lípidos , ADN y moléculas pequeñas. [14] ensayo de inhibición de enzimas: [8] para el cribado de candidatos a fármacos de alto rendimiento y para descubrir nuevas enzimas para su uso en biotecnología ; cribado de la especificidad del anticuerpo. [15]
Referencias
[dieciséis]
- ↑ a b Stevens, RC (2000). "Diseño de métodos de producción de proteínas de alto rendimiento para biología estructural". Estructura 8 (9): R177-R185.
- ^ Katzen, F., G. Chang, et al. (2005). "El pasado, presente y futuro de la síntesis de proteínas libres de células". Trends Biotechnol 23 (3): 150–6.
- ^ a b c Él, M., O. Stoevesandt, et al. (2008). "Síntesis in situ de matrices de proteínas". Curr Opin Biotechnol 19 (1): 4-9.
- ^ a b Ramachandran, N., E. Hainsworth, et al. (2004). "Microarrays de proteínas de autoensamblaje". Science 305 (5680): 86–90.
- ^ Él, M. y MJ Taussig (2001). "Generación en un solo paso de matrices de proteínas a partir de ADN mediante expresión libre de células e inmovilización in situ (método PISA)". Ácidos nucleicos Res 29 (15): E73-3.
- ^ Angenendt, P., J. Kreutzberger, et al. (2006). "Generación de micromatrices de proteínas de alta densidad mediante la expresión in situ sin células de productos de PCR no purificados". Mol Cell Proteomics 5 (9): 1658–66.
- ^ Tao, SC y H. Zhu (2006). "Fabricación de chips de proteínas mediante la captura de polipéptidos nacientes". Nat Biotechnol 24 (10): 1253–4.
- ↑ a b Angenendt, P., L. Nyarsik, et al. (2004). "Expresión de proteínas libres de células y ensayo funcional en formato de chip de nanopozos". Anal Chem 76 (7): 1844–9.
- ^ Kinpara, T., R. Mizuno, et al. (2004). "Una matriz de cámara de picolitros para la síntesis de proteínas sin células". J Biochem 136 (2): 149–54.
- ^ Takulapalli BR, Qiu J, et al. (2012). "Matrices de nanopozos sin difusión de alta densidad". J Proteome Res. 11 (8): 4382-91
- ^ Él, M., O. Stoevesandt, et al. (2008). "Impresión de matrices de proteínas a partir de matrices de ADN". Nat Methods 5 (2): 175–7.
- ^ Guía de expresión in vitro de Promega Archivado el 7 de noviembre de 2007 en la Wayback Machine.
- ^ Chatterjee, DK y J. LaBaer (2006). "Tecnologías de proteínas". Curr Opin Biotech 17 (4): 334–336.
- ^ Él, M. y MW Wang (2007). "Arreglo de proteínas por síntesis libre de células". Biomol Eng 24 (4): 375–80.
- ^ Él, M. y MJ Taussig (2003). "Tecnología DiscernArray: un método sin células para la generación de matrices de proteínas a partir de ADN de PCR". J Immunol Methods 274 (1–2): 265–70.
- ^ [1] .
enlaces externos
- NAPPA
- PISA y DAPA
- Página de recursos de matrices de proteínas