Proyección de alto contenido

El cribado de alto contenido (HCS), también conocido como análisis de alto contenido (HCA) o celómica , es un método que se utiliza en la investigación biológica y el descubrimiento de fármacos para identificar sustancias como moléculas pequeñas , péptidos o ARNi que alteran el fenotipo de una celda de la manera deseada. ^{[1] [2]} Por lo tanto, el cribado de alto contenido es un tipo de cribado fenotípico realizado en células que implica el análisis de células completas o componentes de células con lectura simultánea de varios parámetros. ^[3] HCS está relacionado con el cribado de alto rendimiento.(HTS), en el que se prueban miles de compuestos en paralelo para determinar su actividad en uno o más ensayos biológicos, pero implica ensayos de fenotipos celulares más complejos como resultados. ^[4] Los cambios fenotípicos pueden incluir aumentos o disminuciones en la producción de productos celulares como proteínas y / o cambios en la morfología (apariencia visual) de la célula. Por lo tanto, HCA generalmente implica microscopía automatizada y análisis de imágenes. ^[4] A diferencia del análisis de alto contenido, el cribado de alto contenido implica un nivel de rendimiento, por lo que el término "cribado" diferencia a HCS de HCA, que puede tener un contenido alto pero un rendimiento bajo.

En el cribado de alto contenido, las células se incuban primero con la sustancia y, después de un período de tiempo, se analizan las estructuras y los componentes moleculares de las células. El análisis más común implica marcar proteínas con etiquetas fluorescentes y, finalmente, los cambios en el fenotipo celular se miden mediante análisis de imágenes automatizado . Mediante el uso de etiquetas fluorescentes con diferentes máximos de absorción y emisión, es posible medir varios componentes celulares diferentes en paralelo. Además, las imágenes pueden detectar cambios a nivel subcelular (p. Ej., Citoplasma frente a núcleo frente a otros orgánulos). Por lo tanto, se puede recopilar una gran cantidad de puntos de datos por celda. Además del marcaje fluorescente, se han utilizado varios ensayos sin marcaje en el cribado de alto contenido. ^[5]

Principios generales

Una de las aplicaciones de HCS es el descubrimiento de nuevos fármacos candidatos.

El cribado de alto contenido (HCS) en sistemas basados ​​en células utiliza células vivas como herramientas en la investigación biológica para dilucidar el funcionamiento de las células normales y enfermas. La HCS también se utiliza para descubrir y optimizar nuevos candidatos a fármacos. El cribado de alto contenido es una combinación de la biología celular moderna , con todas sus herramientas moleculares, con microscopía automatizada de alta resolución y manipulación robótica. Las células se exponen primero a productos químicos o reactivos de ARNi . A continuación, se detectan los cambios en la morfología celular mediante análisis de imágenes . Los cambios en las cantidades de proteínas sintetizadas por las células se miden utilizando una variedad de técnicas, como las proteínas verdes fluorescentes fusionadas con proteínas endógenas, o poranticuerpos fluorescentes .

La tecnología se puede utilizar para determinar si un fármaco potencial modifica la enfermedad. Por ejemplo, en los seres humanos , los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) son una gran familia de alrededor de 880 proteínas de la superficie celular que transducen cambios extracelulares en el medio ambiente en una respuesta celular, como desencadenar un aumento en la presión arterial debido a la liberación de un hormona reguladora en el torrente sanguíneo. La activación de estos GPCR puede implicar su entrada en las células y, cuando esto se puede visualizar, puede ser la base de un análisis sistemático de la función del receptor a través de la genética química , el cribado sistemático de todo el genoma o la manipulación fisiológica.

A nivel celular, la adquisición paralela de datos sobre diferentes propiedades celulares, por ejemplo, la actividad de las cascadas de transducción de señales y la integridad del citoesqueleto , es la principal ventaja de este método en comparación con el cribado de alto rendimiento más rápido pero menos detallado . Si bien la HCS es más lenta, la gran cantidad de datos adquiridos permite una comprensión más profunda de los efectos de las drogas.

El cribado automatizado basado en imágenes permite la identificación de pequeños compuestos que alteran los fenotipos celulares y es de interés para el descubrimiento de nuevos fármacos y nuevas herramientas biológicas celulares para modificar la función celular. La selección de moléculas basada en un fenotipo celular no requiere un conocimiento previo de las dianas bioquímicas a las que afectan los compuestos. Sin embargo, la identificación del objetivo biológico facilitará significativamente la optimización preclínica posterior y el desarrollo clínico del compuesto afectado. Dado el aumento en el uso del cribado fenotípico / visual como herramienta biológica celular, se requieren métodos que permitan la identificación bioquímica sistemática de la diana para que estas moléculas tengan un uso amplio. ^[6]La identificación del objetivo se ha definido como el paso limitante de la velocidad en la genética química / cribado de alto contenido. ^[7]

Instrumentación

Un lector de imágenes confocal automatizado

La tecnología de cribado de alto contenido se basa principalmente en microscopía digital automatizada y citometría de flujo , en combinación con sistemas de TI para el análisis y almacenamiento de datos. La tecnología de “alto contenido” o biología visual tiene dos propósitos, primero, adquirir información resuelta espacial o temporalmente sobre un evento y segundo, cuantificarlo automáticamente. Los instrumentos resueltos espacialmente son típicamente microscopios automatizados , y la resolución temporal aún requiere alguna forma de medición de fluorescencia en la mayoría de los casos. Esto significa que muchos instrumentos HCS son ( fluorescencia) microscopios que están conectados a algún tipo de paquete de análisis de imágenes. Estos se encargan de todos los pasos para tomar imágenes fluorescentes de células y proporcionan una evaluación rápida, automatizada e imparcial de los experimentos.

Los instrumentos HCS que se encuentran en el mercado hoy en día se pueden separar en función de una serie de especificaciones que influyen significativamente en la versatilidad y el costo general de los instrumentos. Estos incluyen velocidad, una cámara de células vivas que incluye control de temperatura y CO2 (algunos también tienen control de humedad para imágenes de células vivas a más largo plazo), una pipeta o inyector incorporado para ensayos cinéticos rápidos y modos de imagen adicionales como confocal, campo brillante, contraste de fase y FRET. Una de las diferencias más incisivas es si los instrumentos son ópticos confocales o no. Microscopia confocalse resume como la obtención de imágenes / resolución de un corte delgado a través de un objeto y el rechazo de la luz desenfocada que proviene del exterior de este corte. Las imágenes confocales permiten una señal de imagen más alta al ruido y una resolución más alta que la microscopía de epifluorescencia más comúnmente aplicada . Dependiendo del instrumento, la confocalidad se logra mediante escaneo láser, un solo disco giratorio con orificios o hendiduras, un disco giratorio doble o una rendija virtual. Hay compensaciones de sensibilidad, resolución, velocidad, fototoxicidad, fotoblanqueo, complejidad del instrumento y precio entre estas diversas técnicas confocales.

Lo que comparten todos los instrumentos es la capacidad de tomar, almacenar e interpretar imágenes automáticamente e integrarse en grandes plataformas robóticas de manipulación de células / medios.

Software

Muchas pantallas se analizan utilizando el software de análisis de imágenes que acompaña al instrumento, proporcionando una solución llave en mano. Las alternativas de software de terceros se utilizan a menudo para pantallas particularmente desafiantes o cuando un laboratorio o instalación tiene múltiples instrumentos y desea estandarizar a una sola plataforma de análisis. Sin embargo, algunos software de instrumentos proporcionan importación y exportación masiva de imágenes y datos, para los usuarios que desean realizar dicha estandarización en una única plataforma de análisis sin el uso de software de terceros.

Aplicaciones

Esta tecnología permite realizar una (muy) gran cantidad de experimentos, lo que permite un cribado exploratorio. Los sistemas basados ​​en células se utilizan principalmente en genética química, donde se prueban sistemáticamente colecciones de moléculas pequeñas grandes y diversas para determinar su efecto en los sistemas de modelos celulares. Se pueden encontrar nuevos fármacos utilizando pantallas de decenas de miles de moléculas, y estos son prometedores para el futuro del desarrollo de fármacos. Más allá del descubrimiento de fármacos, la genética química tiene como objetivo funcionalizar el genoma mediante la identificación de pequeñas moléculas que actúan sobre la mayoría de los 21.000 productos génicos de una célula. La tecnología de alto contenido será parte de este esfuerzo que podría proporcionar herramientas útiles para aprender dónde y cuándo actúan las proteínas eliminándolas químicamente.Esto sería más útil para genes en los que no se pueden producir ratones knock out (que faltan uno o varios genes) porque la proteína es necesaria para el desarrollo, el crecimiento o, de otra manera, letal cuando no está allí. La eliminación química podría abordar cómo y dónde funcionan estos genes. Además, la tecnología se utiliza en combinación conRNAi para identificar conjuntos de genes implicados en mecanismos específicos, por ejemplo, la división celular. Aquí, las bibliotecas de ARN, que cubren un conjunto completo de genes predichos dentro del genoma del organismo objetivo, se pueden usar para identificar subconjuntos relevantes, lo que facilita la anotación de genes para los que no se ha establecido un papel claro de antemano. Los grandes conjuntos de datos producidos por la biología celular automatizada contienen datos cuantitativos resueltos espacialmente que pueden usarse para construir modelos a nivel de sistemas y simulaciones de cómo funcionan las células y los organismos. Los modelos de biología de sistemas de la función celular permitirían predecir por qué, dónde y cómo responde la célula a los cambios externos, el crecimiento y la enfermedad.

Historia

La tecnología de cribado de alto contenido permite la evaluación de múltiples parámetros bioquímicos y morfológicos en sistemas biológicos intactos.

Para los enfoques basados ​​en células, la utilidad de la biología celular automatizada requiere un examen de cómo la automatización y la medición objetiva pueden mejorar la experimentación y la comprensión de la enfermedad. En primer lugar, elimina la influencia del investigador en la mayoría de los aspectos de la investigación en biología celular, pero no en todos, y en segundo lugar, hace posibles enfoques completamente nuevos.

En resumen, la biología celular clásica del siglo XX utilizó líneas celulares cultivadas en cultivo donde los experimentos se midieron utilizando métodos muy similares a los descritos aquí, pero allí el investigador tomó la decisión sobre qué se midió y cómo. A principios de 1990, el desarrollo de CCD cámaras ( dispositivo de carga acoplada cámaras ) para la investigación creado la oportunidad de medir características en imágenes de células- tales como la cantidad de proteína se encuentra en el núcleo, la cantidad está fuera. Pronto siguieron mediciones sofisticadas utilizando nuevas moléculas fluorescentes, que se utilizan para medir las propiedades celulares como el segundo mensajero.concentraciones o el pH de los compartimentos celulares internos. El amplio uso de la proteína verde fluorescente, una molécula de proteína fluorescente natural de las medusas, aceleró la tendencia hacia la obtención de imágenes celulares como tecnología principal en biología celular. A pesar de estos avances, la elección de qué celda fotografiar y qué datos presentar y cómo analizarla seguía siendo seleccionada por el investigador.

Por analogía, si uno imagina un campo de fútbol y platos de comida colocados sobre él, en lugar de mirarlos a todos, el investigador elegiría un puñado cerca de la línea de puntuación y tendría que dejar el resto. En esta analogía, el campo es un plato de cultivo de tejidos, las placas son las células que crecen en él. Si bien este fue un enfoque razonable y pragmático, la automatización de todo el proceso y el análisis hace posible el análisis de toda la población de células vivas, por lo que se puede medir todo el campo de fútbol.

Ver también

• Descubrimiento de medicamento
• Proyección de alto impacto
• El éxito del descubrimiento de fármacos para liderar
• Microscopía
• Citometría de flujo
• Imágenes unicelulares en vivo

Referencias

1. Haney SA, ed. (2008). Proyección de alto contenido: ciencia, técnicas y aplicaciones . Nueva York: Wiley-Interscience. ISBN 0-470-03999-X.
2. Giuliano KA, Haskins JR, ed. (2010). Detección de alto contenido: un enfoque poderoso para la biología celular de sistemas y el descubrimiento de fármacos . Totowa, Nueva Jersey: Humana Press. ISBN 1-61737-746-5.
3. Gasparri F (junio de 2009). "Una descripción general de los fenotipos celulares en HCS: limitaciones y ventajas". Opinión de expertos sobre el descubrimiento de fármacos . 4 (6): 643–657. doi : 10.1517 / 17460440902992870 .
4. Varma H, Lo DC, Stockwell BR (2011). "Detección de alto rendimiento y alto contenido para la terapéutica de la enfermedad de Huntington". En Lo DC, Hughes RE (eds.). Neurobiología de la enfermedad de Huntington: aplicaciones al descubrimiento de fármacos . Boca Raton, FL: CRC Press / Taylor & Francis . Consultado el 5 de diciembre de 2018 .
5. Proll G, Steinle L, Pröll F, Kumpf M, Moehrle B, Mehlmann M, Gauglitz G (agosto de 2007). "Potencial de detección sin etiquetas en aplicaciones de cribado de alto contenido". J Chromatogr A . 1161 (1–2): 2–8. doi : 10.1016 / j.chroma.2007.06.022 . PMID 17612548 . 
6. Burdine L, Kodadek T (mayo de 2004). "Identificación de objetivos en genética química: el eslabón perdido (a menudo)" . Chem. Biol . 11 (5): 593–7. doi : 10.1016 / j.chembiol.2004.05.001 . PMID 15157870 . 
7. Eggert US, Mitchison TJ (junio de 2006). "Cribado de moléculas pequeñas por formación de imágenes". Curr Opin Chem Biol . 10 (3): 232–7. doi : 10.1016 / j.cbpa.2006.04.010 . PMID 16682248 . 

Lectura adicional

• Abraham VC, Taylor DL, Haskins JR (enero de 2004). "Cribado de alto contenido aplicado a la biología celular a gran escala". Trends Biotechnol . 22 (1): 15-22. doi : 10.1016 / j.tibtech.2003.10.012 . PMID  14690618 .
• Bleicher KH, Böhm HJ, Müller K, Alanine AI (mayo de 2003). "Hit y generación de clientes potenciales: más allá del cribado de alto rendimiento". Nat Rev Drug Discov . 2 (5): 369–78. doi : 10.1038 / nrd1086 . PMID  12750740 .
• Burdine L, Kodadek T (mayo de 2004). "Identificación de objetivos en genética química: el eslabón perdido (a menudo)" . Chem. Biol . 11 (5): 593–7. doi : 10.1016 / j.chembiol.2004.05.001 . PMID  15157870 .
• Carpenter AE, Sabatini DM (enero de 2004). "Pantallas sistemáticas de función genética en todo el genoma". Nat. Rev. Genet . 5 (1): 11-22. doi : 10.1038 / nrg1248 . PMID  14708012 .
• Edwards BS, Oprea T, Prossnitz ER, Sklar LA (agosto de 2004). "Citometría de flujo para cribado de alto rendimiento y alto contenido". Curr Opin Chem Biol . 8 (4): 392–8. doi : 10.1016 / j.cbpa.2004.06.007 . PMID  15288249 .
• Xu GW, Mawji IA, Macrae CJ, Koch CA, Datti A, Wrana JL, Dennis JW, Schimmer AD (marzo de 2008). "Una pantalla química de alto contenido identifica a la elipticina como un modulador de la localización nuclear de p53". Apoptosis . 13 (3): 413-22. doi : 10.1007 / s10495-007-0175-4 . PMID  18181020 .
• Giuliano KA, Haskins JR, Taylor DL ​​(agosto de 2003). "Avances en el cribado de alto contenido para el descubrimiento de fármacos". Assay Drug Dev Technol . 1 (4): 565–77. doi : 10.1089 / 154065803322302826 . PMID  15090253 .
• Liszewski, Kathy (2014). "Análisis de alto contenido: la solución 'perfecta'" . Gen. Eng. Biotechnol. Noticias . 34 (3).
• Milligan G (julio de 2003). "Ensayos de alto contenido para la regulación de ligando de receptores acoplados a proteína G". Drug Discov. Hoy . 8 (13): 579–85. doi : 10.1016 / S1359-6446 (03) 02738-7 . PMID  12850333 .
• Battich N, Stoeger T, Pelkmans L (octubre de 2013). "Transcriptómica basada en imágenes en miles de células humanas individuales con resolución de molécula única". Métodos de la naturaleza . 10 (11): 1127-1133. doi : 10.1038 / nmeth.2657 . PMID  24097269 .

Enlaces externos

• Directrices para la detección de alto contenido basada en imágenes - NCBI
• La Sociedad de Imagen e Informática Biomolecular