- (Este artículo asume familiaridad con los términos y componentes usados en el proceso de PCR).
La historia de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se ha descrito de diversas formas como un clásico "¡Eureka!" momento, [1] o como un ejemplo de trabajo en equipo cooperativo entre investigadores dispares. [2] A continuación se muestra una lista de eventos antes, durante y después de su desarrollo:
Preludio
- El 25 de abril de 1953 James D. Watson y Francis Crick publicaron "una estructura radicalmente diferente" para el ADN , [3] fundando así el campo de la genética molecular . Su modelo estructural presentaba dos hebras de ADN complementario de pares de bases, corriendo en direcciones opuestas como una doble hélice. Concluyeron su informe diciendo que "no ha pasado desapercibido que el emparejamiento específico que hemos postulado sugiere de inmediato un posible mecanismo de copia del material genético". Por esta idea, fueron galardonados con el Premio Nobel en 1962 .
- A partir de mediados de la década de 1950 , Arthur Kornberg comenzó a estudiar el mecanismo de replicación del ADN . [4] En 1957 identificó la primera ADN polimerasa . [5] La enzima era limitada, creaba ADN en una sola dirección y requería un cebador existente para iniciar la copia de la hebra molde. En general, el proceso de replicación del ADN es sorprendentemente complejo y requiere proteínas separadas para abrir la hélice del ADN, mantenerla abierta, crear cebadores , sintetizar nuevo ADN, eliminar los cebadores y unir todas las piezas. Kornberg recibió el Premio Nobel en 1959 .
- A principios de la década de 1960, H. Gobind Khorana realizó avances significativos en la elucidación del código genético . Posteriormente, inició un gran proyecto para sintetizar totalmente un gen humano funcional . [6] Para lograr esto, Khorana fue pionera en muchas de las técnicas necesarias para fabricar y utilizar oligonucleótidos de ADN sintético . Se usaron oligonucleótidos específicos de secuencia como bloques de construcción para el gen y como cebadores y moldes para la ADN polimerasa. En 1968, Khorana recibió el Premio Nobel por su trabajo sobre el Código Genético.
- En 1969, Thomas D. Brock informó del aislamiento de una nueva especie de bacteria de una fuente termal en el Parque Nacional Yellowstone . Thermus aquaticus [7] (Taq), se convirtió en una fuente estándar de enzimas capaces de soportar temperaturas más altas que las de E. Coli .
- En 1970, Klenow informó sobre una versión modificada de la ADN polimerasa I de E. coli . [8] El tratamiento con una proteasa eliminó la actividad nucleasa "directa" de esta enzima. Por lo tanto, la actividad general del fragmento de Klenow resultante está sesgada hacia la síntesis de ADN, en lugar de su degradación.
- En 1971, los investigadores del proyecto de Khorana, preocupados por la producción de ADN, comenzaron a buscar la "síntesis de reparación", un sistema artificial de cebadores y plantillas que permite que la ADN polimerasa copie segmentos del gen que están sintetizando. Aunque es similar a la PCR en el uso de aplicaciones repetidas de ADN polimerasa, el proceso que generalmente describen [9] emplea un único complejo cebador-molde y, por lo tanto, no conduciría a la amplificación exponencial observada en la PCR.
- Hacia 1971, Kjell Kleppe , un investigador del laboratorio de Khorana, imaginó un proceso muy similar a la PCR. Al final de un artículo sobre la técnica anterior, [10] describió cómo un sistema de dos cebadores podría conducir a la replicación de un segmento específico de ADN:
- "uno esperaría obtener dos estructuras, cada una conteniendo la longitud completa de la hebra plantilla apropiadamente complejada con el cebador. Se agregará ADN polimerasa para completar el proceso de reparación de la replicación. Deberían resultar dos moléculas del dúplex original. El ciclo completo podría repetirse, añadiéndose cada vez una nueva dosis de la enzima ". [10]
- No se muestran resultados allí, y la mención de experimentos no publicados en otro artículo [9] puede (o no) referirse al sistema de replicación de dos cebadores. (Estos primeros precursores de la PCR se analizaron cuidadosamente en una demanda de patentes y se analizan en los capítulos de Mullis en The Polymerase Chain Reaction (1994). [11] )
- También en 1971 , Cetus Corporation fue fundada en Berkeley, California por Ronald Cape, Peter Farley y Donald Glaser. Inicialmente, la empresa examinó microorganismos capaces de producir componentes utilizados en la fabricación de alimentos, productos químicos, vacunas o productos farmacéuticos. Después de mudarse a la cercana Emeryville , comenzaron proyectos relacionados con la nueva industria de la biotecnología , principalmente la clonación y expresión de genes humanos, pero también el desarrollo de pruebas de diagnóstico para mutaciones genéticas.
- En 1976 se aisló una ADN polimerasa [12] de T. aquaticus . Se encontró que conservaba su actividad a temperaturas superiores a 75 ° C.
- En 1977, Frederick Sanger informó sobre un método para determinar la secuencia de ADN. [13] La técnica empleó un cebador de oligonucleótidos , ADN polimerasa y precursores de nucleótidos modificados que bloquean la extensión adicional del cebador de manera dependiente de la secuencia. Por esta innovación fue galardonado con el Premio Nobel en 1980 .
En 1980, la comunidad científica conocía todos los componentes necesarios para realizar la amplificación por PCR. El uso de ADN polimerasa para extender cebadores de oligonucleótidos fue un procedimiento común en la secuenciación de ADN y la producción de ADNc para clonación y expresión . El uso de ADN polimerasa para la traducción de mellas fue el método más común utilizado para marcar sondas de ADN para transferencia Southern .
Tema
- En 1979, Cetus Corporation contrató a Kary Mullis para sintetizar oligonucleótidos para varios proyectos de investigación y desarrollo en toda la empresa. [14] Estos oligonucleótidos se utilizaron como sondas para la detección de genes clonados, como cebadores para la secuenciación del ADN y la síntesis de ADNc, y como bloques de construcción para la construcción de genes. Originalmente sintetizando estos oligos a mano, Mullis luego evaluó los primeros prototipos de sintetizadores automáticos. [1]
- En mayo de 1983, Mullis sintetizó sondas de oligonucleótidos para un proyecto en Cetus para analizar una mutación de anemia de células falciformes . Al enterarse de los problemas con su trabajo, Mullis propuso una técnica alternativa basada en el método de secuenciación del ADN de Sanger . [14] Al darse cuenta de la dificultad de hacer que el método Sanger sea específico para una sola ubicación en el genoma, Mullis modificó la idea para agregar un segundo cebador en la hebra opuesta. Las aplicaciones repetidas de polimerasa podrían conducir a una reacción en cadena de replicación para un segmento específico del genoma: PCR.
- Más tarde, en 1983, Mullis comenzó a probar su idea. Su primer experimento [2] no involucró ciclos térmicos; esperaba que la polimerasa pudiera realizar una replicación continua por sí misma. Los experimentos posteriores de ese año incluyeron ciclos térmicos repetidos y se enfocaron en pequeños segmentos de un gen clonado. Mullis consideró estos experimentos un éxito, pero no pudo convencer a otros investigadores.
- En junio de 1984, Cetus celebró su reunión anual en Monterey, California . Sus científicos y consultores presentaron sus resultados y consideraron proyectos futuros. Mullis presentó un póster sobre la producción de oligonucleótidos en su laboratorio y presentó algunos de los resultados de sus experimentos con PCR. [2] Solo Joshua Lederberg , consultor de Cetus, mostró interés. [14] Más tarde en la reunión, Mullis estuvo involucrado en un altercado físico con otro investigador de Cetus por una disputa no relacionada con PCR. [2] El otro científico dejó la empresa y Mullis fue destituido como jefe del laboratorio de síntesis de oligo.
Desarrollo
- En septiembre de 1984, Tom White, vicepresidente de investigación de Cetus (y un amigo cercano), presionó a Mullis para que llevara su idea al grupo que desarrollaba el ensayo de mutación genética. Juntos, pasaron los siguientes meses diseñando experimentos que podrían mostrar de manera convincente que la PCR funciona con el ADN genómico. Desafortunadamente, el producto de amplificación esperado no fue visible en la electroforesis en gel de agarosa , [15] lo que generó confusión en cuanto a si la reacción tenía alguna especificidad para la región objetivo.
- En noviembre de 1984 [2], los productos de amplificación se analizaron mediante transferencia Southern , lo que demuestra claramente una cantidad creciente del producto de ADN de 110 pb esperado . [16] Al tener la primera señal visible, los investigadores comenzaron a optimizar el proceso. Posteriormente, los productos amplificados se clonaron y secuenciaron, mostrando que solo una pequeña fracción del ADN amplificado es la diana deseada, y que el fragmento de Klenow que se usa entonces solo rara vez incorpora nucleótidos incorrectos durante la replicación. [15]
Exposición
- Siguiendo la práctica industrial normal, Mullis solicitó [17] una patente que cubría la idea básica de la PCR y muchas aplicaciones potenciales, y la PTO le pidió que incluyera más resultados. El 28 de marzo de 1985, el grupo de desarrollo de Mullis presentó una solicitud [18] centrada en el análisis de la mutación de la anemia de células falciformes mediante PCR y restricción de oligómeros . Después de la modificación, ambas patentes fueron aprobadas el 28 de julio de 1987 .
- En la primavera de 1985, el grupo de desarrollo comenzó a aplicar la técnica de PCR a otros objetivos. Se diseñaron cebadores y sondas para un segmento variable del gen DQα del antígeno leucocitario humano. Esta reacción fue mucho más específica que la del objetivo de la β-hemoglobina: el producto de PCR esperado [15] es directamente visible en la electroforesis en gel de agarosa . Los productos de amplificación de diversas fuentes también se clonaron y secuenciaron, la primera determinación de nuevos alelos por PCR. [15] Al mismo tiempo, la técnica de ensayo de restricción de oligómeros original fue reemplazada por el método de oligonucleótidos específicos de alelos más general . [19]
- También a principios de 1985 , el grupo comenzó a utilizar una ADN polimerasa termoestable (la enzima utilizada en la reacción original se destruye en cada paso de calentamiento). En ese momento [1] sólo se habían descrito dos, de Taq y Bst . El informe sobre la polimerasa Taq [12] fue más detallado, por lo que se eligió para la prueba. Más tarde se descubrió que la polimerasa Bst no era adecuada para la PCR [ cita requerida ] . Ese verano, Mullis intentó aislar la enzima, y se contrató a un grupo fuera de Cetus para hacerlo, todo sin éxito. En el otoño de 1985, Susanne Stoffel y David Gelfand en Cetus lograron fabricar la polimerasa, y Randy Saiki descubrió inmediatamente que apoyaba el proceso de PCR.
- Con las patentes presentadas, se procedió a trabajar para informar sobre la PCR a la comunidad científica en general. En abril de 1985 se presentó un resumen para una reunión de la Sociedad Estadounidense de Genética Humana en Salt Lake City , y Saiki hizo allí el primer anuncio de PCR en octubre . [20] Se planearon dos publicaciones: un documento de "idea" de Mullis y un documento de "aplicación" de todo el grupo de desarrollo. Mullis envió su manuscrito a la revista Nature , que lo rechazó por no incluir resultados. El otro artículo, que describe principalmente el análisis de OR , se envió a Science el 20 de septiembre de 1985 y fue aceptado en noviembre. Después del rechazo del informe de Mullis en diciembre, los detalles sobre el proceso de PCR se agregaron apresuradamente al segundo documento, que aparece el 20 de diciembre de 1985 . [dieciséis]
- En mayo de 1986, Mullis presentó PCR en el Simposio de Cold Spring Harbor, [21] y publicó una versión modificada de su manuscrito original de la "idea" mucho más tarde. [22] El primer informe que no fue de Cetus que utilizó PCR se presentó el 5 de septiembre de 1986 , [23] indicando la rapidez con la que otros laboratorios comenzaron a implementar la técnica. El grupo de desarrollo de Cetus publicó su análisis de secuencia detallado de productos de PCR el 8 de septiembre de 1986 , [15] y su uso de sondas ASO el 13 de noviembre de 1986 . [19]
- Henry Erlich anunció el uso de la polimerasa Taq en la PCR en una reunión celebrada en Berlín el 20 de septiembre de 1986 , se presentó para su publicación en octubre de 1987 y se publicó a principios del año siguiente ». [24] La patente para PCR con polimerasa Taq se presentó el 17 de junio de 1987 y se emitió el 23 de octubre de 1990 . [25]
Variación
- En diciembre de 1985 se estableció una empresa conjunta entre Cetus y Perkin-Elmer para desarrollar instrumentos y reactivos para PCR. Los termocicladores complejos se construyeron para realizar las amplificaciones basadas en Klenow, pero nunca se comercializaron. Se desarrollaron máquinas más sencillas para la PCR basada en Taq, y el 19 de noviembre de 1987 un comunicado de prensa anuncia la disponibilidad comercial del "PCR-1000 Thermal Cycler" y la "AmpliTaq DNA Polymerase".
- En la primavera de 1985, John Sninsky de Cetus comenzó a utilizar la PCR para la difícil tarea de medir la cantidad de VIH que circula en la sangre. Se anunció una prueba viable el 11 de abril de 1986 y se publicó en mayo de 1987 . [26] La sangre donada podría luego analizarse para detectar el virus y monitorearse directamente el efecto de los medicamentos antivirales.
- En 1985 Norm Arnheim, también miembro del equipo de desarrollo, concluyó su año sabático en Cetus y asumió un puesto académico en la USC . Comenzó a investigar el uso de la PCR para amplificar muestras que contenían solo una copia de la secuencia objetivo. En 1989, su laboratorio desarrolló PCR multiplex en un solo espermatozoide para analizar directamente los productos de la recombinación meiótica. [27] Estas amplificaciones de copia única, que se habían realizado por primera vez durante la caracterización de la polimerasa Taq, [24] se volvieron vitales para el estudio del ADN antiguo , así como para la tipificación genética de embriones preimplantados.
- En 1986, Edward Blake, un científico forense que trabajaba en el edificio Cetus, colaboró con Henry Erlich, investigador de Cetus, para aplicar la PCR al análisis de pruebas penales. Se recogió y codificó un panel de muestras de ADN de casos antiguos, y Saiki las analizó a ciegas utilizando el ensayo HLA DQα. Cuando se rompió el código, todas las pruebas y los perpetradores coincidieron. El grupo de Blake y Erlich utilizó la técnica casi de inmediato en "Pennsylvania v. Pestinikas", [28] el primer uso de PCR en un caso penal. Esta prueba DQα es desarrollada por Cetus como uno de sus kits "Ampli-Type" y se convirtió en parte de los primeros protocolos para la prueba de evidencia forense, como en el caso del asesinato de OJ Simpson .
- En 1989, Alec Jeffreys , que había desarrollado y aplicado las primeras pruebas de huellas dactilares de ADN , utilizó la PCR para aumentar su sensibilidad. [29] Con más modificaciones, la amplificación de loci VNTR altamente polimórficos se convirtió en el protocolo estándar para bases de datos nacionales de ADN como CODIS .
- En 1987, Russ Higuchi logró amplificar el ADN de un cabello humano. [30] Este trabajo se expandió para desarrollar métodos para la amplificación de ADN a partir de muestras altamente degradadas, como ADN antiguo y en evidencia forense .
Coda
- El 22 de diciembre de 1989, la revista Science otorgó a Taq Polymerase (y PCR) su primera "Molécula del año". El artículo 'Taq PCR' [24] se convirtió durante varios años en la publicación más citada en biología.
- Después de la publicación del primer artículo de PCR, [16] el gobierno de los Estados Unidos envió una carta severa a Randy Saiki, amonestándolo por publicar un informe sobre "reacciones en cadena" sin la revisión y aprobación previas requeridas por el Departamento de Energía de los Estados Unidos . Cetus respondió, explicando las diferencias entre la PCR y la bomba atómica . [ cita requerida ]
- El 23 de julio de 1991 Cetus anunció su venta a la empresa de biotecnología vecina Chiron . Como parte de la venta, los derechos de las patentes de PCR se vendieron por USD $ 300 millones a Hoffman-La Roche (quien en 1989 había comprado derechos limitados de PCR). Muchos de los investigadores de Cetus PCR se trasladaron a la filial de Roche , Roche Molecular Systems .
- El 13 de octubre de 1993, Kary Mullis , que había dejado Cetus en 1986 , recibió el Premio Nobel de Química . En la mañana de su discurso de aceptación, [1] estuvo a punto de ser arrestado por las autoridades suecas por "uso inapropiado de un puntero láser". [31]
Referencias
- ^ a b c d Conferencia Nobel de Kary Mullis, 8 de diciembre de 1993
- ^ a b c d e Rabinow P "Making PCR: A Story of Biotechnology" University of Chicago Press (1996) ISBN 0-226-70147-6
- ^ Watson JD, Crick FHC "Una estructura para el ácido nucleico desoxirribosa", Nature vol. 171, págs. 737–738 (1953). [1]
- ^ (Descubrimiento de la ADN polimerasa I de Arthur Kornberg) J. Biol. Chem. vol. 280, pág. 46. [2]
- ^ Lehman, IR, Bessman MJ, Simms ES, Kornberg A "Síntesis enzimática de ácido desoxirribonucleico. I. Preparación de sustratos y purificación parcial de una enzima de Escherichia coli" J. Biol. Chem. vol. 233 (1) págs. 163-170 (1958).
- ^ Khorana HG y col. "Síntesis total del gen estructural para el precursor de un ARN de transferencia supresor de tirosina de Escherichia coli. 1. Introducción general" J. Biol. Chem. vol. 251 (3) págs. 565-70 (1976).
- ^ Brock TD, Freeze H "Thermus aquaticus, un termófilo extremo no esporulante" J. Bacteriol. vol. 98 (1) págs. 289-297 (1969).
- ^ Klenow H y Henningsen I "Eliminación selectiva de la actividad exonucleasa de la polimerasa del ácido desoxirribonucleico de Escherichia coli B por proteólisis limitada" Proc Natl Acad Sci vol. 65 págs. 168–75 (1970).
- ^ a b Panet A, Khorana HG "Estudios sobre polinucleótidos" J. Biol. Chem. vol. 249 (16), págs. 5213-21 (1974).
- ^ a b Kleppe K, Ohtsuka E, Kleppe R, Molineux I, Khorana HG "Estudios sobre polinucleótidos. XCVI. Reparación de replicaciones de ADN sintéticos cortos catalizados por ADN polimerasas". J. Molec. Biol. vol. 56, págs. 341-61 (1971).
- ^ Mullis KB, Ferré F, Gibbs RA "La reacción en cadena de la polimerasa" Birkhäuser Press (1994) ISBN 0-8176-3750-8
- ^ a b Chien A, Edgar DB, Trela JM "Polimerasa de ácido desoxirribonucleico del termófilo extremo Thermus aquaticus" J. Bacteriol. vol. 174 págs. 1550-1557 (1976).
- ^ Sanger F, Nicklen S, Coulson AR "Secuenciación de ADN con inhibidores de terminación de cadena" Proc Natl Acad Sci vol. 74 (12) págs. 5463-7 (1977).
- ^ a b c Mullis KB "Los orígenes inusuales de la reacción en cadena de la polimerasa" Scientific American, vol. 262, págs. 56–65 (abril de 1990).
- ^ a b c d e Scharf y col. "Clonación directa y análisis de secuencia de secuencias genómicas amplificadas enzimáticamente" Science vol. 233, págs. 1076–78 (1986).
- ^ a b c Saiki RK y col. "Amplificación enzimática de secuencias genómicas de β-globina y análisis de sitios de restricción para el diagnóstico de anemia de células falciformes" Science vol. 230 págs. 1350–54 (1985).
- ^ Mullis KB "Proceso para amplificar secuencias de ácidos nucleicos". Patente de Estados Unidos 4.683.202 .
- ^ Mullis, KB y col. "Proceso para amplificar, detectar y / o clonar secuencias de ácidos nucleicos". Patente de Estados Unidos 4.683.195 .
- ^ a b Saiki y col. "Análisis de ADN de β-globina y HLA DQα amplificado enzimáticamente con sondas oligonucleotídicas específicas de alelo". Nature vol. 324 (6093) págs. 163-6 (1986).
- ^ Saiki, R y col. "Un nuevo método para el diagnóstico prenatal de la anemia de células falciformes" Amer. Soc. Human Genetics, 9 al 13 de octubre de 1985.
- ^ Mullis KB y col. "Amplificación enzimática específica de ADN in vitro: la reacción en cadena de la polimerasa". Arb de resorte frío. Symp. Quant. Biol. vol. 51 págs. 263–73 (1986).
- ^ Mullis KB y Faloona FA "Síntesis específica de ADN in vitro a través de una reacción en cadena catalizada por polimerasa". Methods in Enzymology vol. 155 (F) págs. 335-50 (1987).
- ^ Verlaan-de Vries M et al. "Un procedimiento de detección de transferencia puntual para oncogenes ras mutados utilizando oligodesoxinucleótidos sintéticos". Gene vol. 50 (1-3) págs. 313-20 (1986).
- ^ a b c Saiki y col. "Amplificación enzimática de ADN dirigida por cebadores con una ADN polimerasa termoestable". Science vol. 239 págs. 487–91 (1988).
- ^ Mullis, KB y col. "Proceso para amplificar, detectar y / o clonar secuencias de ácidos nucleicos usando una enzima termoestable". Patente de Estados Unidos 4.965.188 .
- ^ Kwok S y col. "Identificación de secuencias de VIH mediante amplificación enzimática in vitro y detección de escisión de oligómeros". J. Virol. vol. 61 (5) págs. 1690–4 (1987).
- ^ Boehnke M y col. "Mapeo genético de estructura fina de cromosomas humanos utilizando la reacción en cadena de la polimerasa en un solo espermatozoide". Am J Hum Genet vol. 45 (1) págs. 21-32 (1989).
- ^ "Cronología de la ciencia forense (PDF)" (PDF) . Archivado desde el original (PDF) el 2008-07-09 . Consultado el 12 de abril de 2008 .
- ^ Jeffreys A y col. "Amplificación de minisatélites humanos". Investigación de ácidos nucleicos vol. 23 págs. 10953 - 71 (1988).
- ^ Higuchi R y col. "Tipificación de ADN de un solo cabello". Nature vol. 332 (6164) págs. 543-6 (1988).
- ^ Mullis KB "Bailando desnudo en el campo mental" Pantheon Books (1998) ISBN 0-679-44255-3