El lisado de amebocitos de Limulus ( LAL ) es un extracto acuoso de células sanguíneas ( amebocitos ) del cangrejo herradura del Atlántico Limulus polyphemus . El LAL reacciona con el lipopolisacárido de endotoxina bacteriana (LPS), que es un componente de la membrana de las bacterias gramnegativas . Esta reacción es la base de la prueba LAL , que se utiliza ampliamente para la detección y cuantificación de endotoxinas bacterianas .
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En Asia, ocasionalmente se utiliza una prueba similar de lisado de amebocitos de Tachypleus ( TAL ) basada en los cangrejos herradura locales Tachypleus gigas o Tachypleus tridentatus . [1] El ensayo del factor C recombinante (rFC) es un reemplazo de LAL / TAL basado en una reacción similar. [2]
Fondo
Fred Bang informó en 1956 que las bacterias gramnegativas, incluso si mueren, harán que la sangre del cangrejo herradura se convierta en una masa semisólida. Más tarde se reconoció que las células sanguíneas del animal, células móviles llamadas amebocitos , contienen gránulos con un factor de coagulación conocido como coagulógeno ; esta se libera fuera de la célula cuando se encuentra una endotoxina bacteriana. Se cree que la coagulación (gelificación) resultante contiene infecciones bacterianas en el sistema circulatorio semicerrado del animal . [3] El análisis moderno del lisado ha llevado a comprender este sistema de cascada, con múltiples enzimas trabajando en secuencia para producir el gel. El punto de entrada de la coagulación inducida por endotoxinas es el factor de coagulación C de Limulus. [4]
En 1977, la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) aprobó LAL para analizar medicamentos, productos y dispositivos que entran en contacto con la sangre. Antes de esa fecha, se había utilizado para este propósito una prueba mucho más lenta y costosa en conejos . [5]
Se recolectan cangrejos herradura y se extrae sangre del pericardio del cangrejo herradura ; los cangrejos luego se devuelven al agua. Los fabricantes de LAL han medido tasas de mortalidad del 3% en cangrejos desangrados; sin embargo, estudios recientes indican que este número puede estar más cerca del 15% [6] o incluso del 30%. [7] Las células sanguíneas se separan del suero mediante centrifugación y luego se colocan en agua destilada, lo que hace que se hinchen y revienten ("lisar"). Esto libera las sustancias químicas del interior de la célula (el "lisado"), que luego se purifica y se liofiliza . Para analizar una muestra de endotoxinas, se mezcla con lisado y agua; las endotoxinas están presentes si se produce la coagulación. [8]
La prueba LAL
Hay tres metodologías básicas: gel-coágulo, turbidimétrico y cromogénico. La aplicación principal de LAL es la prueba de productos farmacéuticos y dispositivos médicos parenterales que entran en contacto con sangre o líquido cefalorraquídeo . En los Estados Unidos, la FDA ha publicado una guía para la validación de la prueba LAL como prueba de endotoxinas para dichos productos. [9]
La cascada de LAL también es desencadenada por (1,3) -β-D- glucano , a través de un factor G diferente. Tanto las endotoxinas bacterianas como el (1,3) -β-D-glucano se consideran patrones moleculares asociados a patógenos , o PAMP , sustancias que provocan respuestas inflamatorias en mamíferos . [10]
Superar la inhibición y la mejora
Uno de los aspectos de las pruebas de endotoxinas que consumen más tiempo con LAL es el tratamiento previo de las muestras para superar la inhibición del ensayo que puede interferir con la prueba de LAL, de modo que la recuperación de endotoxinas se vea afectada. Si el producto que se está probando hace que la recuperación de endotoxinas sea menor de lo esperado, el producto inhibe la prueba LAL. Los productos que provocan valores superiores a los esperados están mejorando. La FDA exige superar las propiedades de inhibición y mejora de un producto como parte de la validación de la prueba LAL para su uso en la prueba de liberación final de inyectables y dispositivos médicos. Se debe probar la recuperación adecuada de endotoxinas antes de que se pueda usar LAL para liberar el producto. [11]
Alternativas
Factor C recombinante
La prueba LAL es una fuente importante de dependencia de productos animales en la industria biomédica, y con informes de una tasa de mortalidad más alta de lo previsto, se ha considerado más ético idear alternativas a la prueba. La idea de que alejarse de LAL para reducir el uso de cangrejos herradura del Atlántico ayudará a los esfuerzos de conservación debe evaluarse cuidadosamente, ya que el cambio a rFC podría producir efectos contraproducentes al poner en peligro los esfuerzos de conservación que muchos han luchado por implementar. Desde 2003, se encuentra disponible comercialmente un sustituto sintético de la prueba LAL. Denominado el ensayo del factor C recombinante (rFC), se basa en la misma proteína del factor de coagulación C de Limulus , producida por organismos modificados genéticamente como las células intestinales de insectos. (La secuencia específica del factor C utilizada no proviene necesariamente del cangrejo herradura del Atlántico). [5]
En lugar de emular toda la vía de coagulación, las pruebas de rFC permiten que el factor C escinda una molécula fluorogénica, de modo que la muestra se ilumina cuando la endotoxina activa el factor. Dado que no contiene factor G, el (1,3) -β-D-glucano no causará falsos positivos . A partir de 2018, la evidencia disponible muestra que la prueba rFC no es peor que la prueba LAL. [12]
La adopción de la prueba rFC fue lenta, lo que comenzó a cambiar en 2012 cuando la FDA de EE. UU. Y el ministerio de salud europeo la reconocieron como una alternativa aceptada. Su falta de mención en las farmacopeas siguió siendo un problema, ya que no existía un buen estándar para ejecutar la prueba en producción. [12] En 2016, se añadió a la Farmacopea Europea . [5] Una patente sobre rFC también limitó la adopción hasta su expiración en 2018. [12]
El 1 de junio de 2020, la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) decidió cancelar la propuesta de incluir tecnología recombinante para pruebas de endotoxinas en el capítulo <85> Endotoxinas bacterianas y comenzar el desarrollo de un capítulo separado que amplía el uso, validación y comparabilidad de Pruebas de endotoxinas basadas en reactivos derivados de forma recombinante. La USP propuso una guía separada solo para el capítulo 1085.1, aunque los comentarios y comentarios publicados el 11 de diciembre de 2020 muestran que las compañías farmacéuticas y la FDA no apoyan este capítulo y solicitan el estado de compendio. [13]
Prueba de activación de monocitos
La prueba de activación de monocitos (MAT) es otro método propuesto para analizar endotoxinas basadas en monocitos en sangre humana . Mide la liberación de citocinas de estos debido a la presencia de pirógenos , básicamente reflejando el proceso por el cual estas toxinas causan fiebre en humanos (y conejos, como en la prueba de pirógenos original). [14] En la Farmacopea Europea se describe un protocolo para la prueba MAT, que utiliza células cultivadas. [15]
Ver también
- Enzima de coagulación de Limulus
- Lipopolisacárido
Referencias
- ^ Sheng J, Zhou J, Peng Y, Zhu Z, Chen L (1 de enero de 2006). "Prueba de lisado de amebocitos de taquiplo usando en reacción de transfusión" . Revista China de Nosocomiología (en chino).
- ^ "Fabricantes de pruebas de endotoxinas y conservación" . www.horseshoecrab.org . Consultado el 10 de marzo de 2020 .
- ^ Greer S. "Frederik Bang" . Escuela de Salud Pública JH Bloomberg . Escuela de Salud Pública Johns Hopkins Bloomberg.
- ^ Iwanaga S (mayo de 2007). "Principio bioquímico de la prueba de Limulus para la detección de endotoxinas bacterianas" . Actas de la Academia de Japón. Serie B, Ciencias Físicas y Biológicas . 83 (4): 110–9. doi : 10.2183 / pjab.83.110 . PMC 3756735 . PMID 24019589 .
- ^ a b c Zhang S (9 de mayo de 2018). "Los últimos días de la cosecha de sangre azul" . El Atlántico . Consultado el 15 de mayo de 2018 .
- ^ "Crash: una historia de dos especies: los beneficios de la sangre azul" . PBS. 10 de junio de 2008.
- ^ Leschen AS, Correia SJ (marzo de 2010). "Mortalidad en hembras de cangrejo herradura (Limulus polyphemus) por sangrado y manipulación biomédicos: implicaciones para la ordenación pesquera" (PDF) . Comportamiento y fisiología marina y de agua dulce . 43 (2): 135–47. doi : 10.1080 / 10236241003786873 . S2CID 35152647 . Archivado desde el original (PDF) el 14 de junio de 2010.
- ^ "La historia de Limulus y endotoxinas" . Laboratorio de Biología Marina . Archivado desde el original el 28 de octubre de 2008.
- ^ "Orientación para la industria: pruebas de pirógenos y endotoxinas: preguntas y respuestas" . Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos . Consultado el 5 de marzo de 2019 .
- ^ Sandle T (agosto de 2013). "Impurezas de productos farmacéuticos: considerando beta glucanos". Revista farmacéutica estadounidense . 16 (5 Suplemento S1): 16-19.
- ^ Williams KL, ed. (2007). Pirógenos de endotoxinas, pruebas de LAL y despirogenación (3ª ed.). Nueva York: Informa Healthcare. pag. 342. ISBN 978-1420020595. Consultado el 7 de marzo de 2015 .
Se debe probar la recuperación adecuada de endotoxinas antes de que se pueda usar LAL para liberar el producto.
- ^ a b c Maloney T, Phelan R, Simmons N (octubre de 2018). "Salvar al cangrejo herradura: una alternativa sintética a la sangre de cangrejo herradura para la detección de endotoxinas" . PLOS Biología . 16 (10): e2006607. doi : 10.1371 / journal.pbio.2006607 . PMC 6200278 . PMID 30312293 .
- ^ https://www.uspnf.com/sites/default/files/usp_pdf/EN/USPNF/usp-nf-notices/1085-1-pf-comments-20201211.pdf
- ^ "Métodos alternativos de prueba de endotoxinas" . www.horseshoecrab.org .
- ^ "Prueba de activación de monocitos: desde la validación hasta las pruebas de laboratorio de GMP" . Revista farmacéutica estadounidense .
enlaces externos
- horseshoecrab.org
- Actualización LAL
- Producto de detección de endotoxinas
- Directriz de prueba LAL de la FDA de 1987
- Reactivos de prueba LAL