El diagnóstico molecular es una colección de técnicas utilizadas para analizar marcadores biológicos en el genoma y proteoma , y cómo sus células expresan sus genes como proteínas , aplicando la biología molecular a las pruebas médicas . En medicina la técnica se utiliza para diagnosticar y monitorización de la enfermedad, detectar el riesgo y decidir qué terapias que funciona mejor para los pacientes individuales, [1] [2] ( prólogo ) y en la bioseguridad agrícola de manera similar a monitorear cultivo- y las enfermedades del ganado , la estimación del riesgo y decide quedeben tomarse medidas de cuarentena . [3]
Al analizar las particularidades del paciente y su enfermedad, el diagnóstico molecular ofrece la perspectiva de una medicina personalizada . [4] Estas pruebas son útiles en una variedad de especialidades médicas , que incluyen enfermedades infecciosas , oncología , tipificación de antígenos leucocitarios humanos (que investiga y predice la función inmunitaria ), coagulación y farmacogenómica , la predicción genética de qué fármacos funcionarán mejor. [5] ( v-vii ) Se superponen con la química clínica (pruebas médicas en fluidos corporales).
Historia
El campo de la biología molecular creció a finales del siglo XX, al igual que su aplicación clínica. En 1980, Yuet Wai Kan et al . sugirió una prueba genética prenatal para la talasemia que no se basaba en la secuenciación del ADN, entonces en su infancia, sino en enzimas de restricción que cortan el ADN donde reconocen secuencias cortas específicas, creando diferentes longitudes de cadena de ADN dependiendo de qué alelo (variación genética) el feto poseído. [6] En la década de 1980, la frase se utilizó en los nombres de empresas como Molecular Diagnostics Incorporated [7] y Bethseda Research Laboraties Molecular Diagnostics . [8] [9]
Durante la década de 1990, la identificación de genes recién descubiertos y las nuevas técnicas de secuenciación del ADN llevaron a la aparición de un campo distinto de la medicina de laboratorio molecular y genómica; en 1995, se formó la Asociación de Patología Molecular (AMP) para darle estructura. En 1999, AMP cofundó The Journal of Medical Diagnostics . [10] Informa Healthcare lanzó Expert Reviews in Medical Diagnostics en 2001. [1] Desde 2002 en adelante, el Proyecto HapMap agregó información sobre las diferencias genéticas de una letra que se repiten en la población humana (los polimorfismos de un solo nucleótido) y su relación con la enfermedad. . [2] ( cap. 37 ) En 2012, las técnicas de diagnóstico molecular para la talasemia utilizan pruebas de hibridación genética para identificar el polimorfismo de un solo nucleótido específico que causa la enfermedad de un individuo. [11]
A medida que la aplicación comercial de los diagnósticos moleculares se ha vuelto más importante, también lo ha hecho el debate sobre el patentamiento de los descubrimientos genéticos en su núcleo . En 1998, la Unión Europea 's la Directiva 98/44 / ECclarified que las patentes sobre secuencias de ADN fueron permisible. [12] En 2010 en los EE. UU., AMP demandó a Myriad Genetics para impugnar las patentes de esta última con respecto a dos genes, BRCA1 , BRCA2 , que están asociados con el cáncer de mama. En 2013, la Corte Suprema de EE. UU. Estuvo de acuerdo parcialmente y dictaminó que una secuencia genética natural no podía patentarse. [13] [14]
Técnicas
Desarrollo a partir de herramientas de investigación
La industrialización de las herramientas de ensayo de biología molecular ha hecho que su uso en clínicas sea práctico. [2] ( prólogo ) La miniaturización en un solo dispositivo de mano puede llevar el diagnóstico médico a la clínica y al consultorio o al hogar. [2] ( prólogo ) El laboratorio clínico requiere altos estándares de confiabilidad; los diagnósticos pueden requerir acreditación o estar sujetos a las regulaciones de dispositivos médicos. [15] A partir de 2011[actualizar], algunos laboratorios clínicos de EE. UU. utilizaron, no obstante, ensayos vendidos para "uso exclusivo en investigación". [dieciséis]
Procesos de laboratorio tienen que cumplir con los reglamentos, tales como las enmiendas Clinical Laboratory Improvement , portabilidad del seguro médico y la Ley de Responsabilidad , Buenas Prácticas de Laboratorio , y el Food and Drug Administration especificaciones en los Estados Unidos. Los sistemas de gestión de la información de laboratorio ayudan mediante el seguimiento de estos procesos. [17] El reglamento se aplica tanto al personal como a los suministros. A partir de 2012[actualizar], doce estados de EE. UU. exigen que los patólogos moleculares tengan licencia; varias juntas, como la Junta Estadounidense de Genética Médica y la Junta Estadounidense de Patología, certifican a los tecnólogos, supervisores y directores de laboratorio. [18]
La automatización y los códigos de barras de muestra maximizan el rendimiento y reducen la posibilidad de error o contaminación durante la manipulación manual y el informe de resultados. Ahora se encuentran disponibles dispositivos únicos para realizar el ensayo de principio a fin. [15]
Ensayos
El diagnóstico molecular utiliza ensayos biológicos in vitro como PCR- ELISA o hibridación fluorescente in situ . [19] [20] El ensayo detecta una molécula, a menudo en concentraciones bajas, que es un marcador de enfermedad o riesgo en una muestra tomada de un paciente. La conservación de la muestra antes del análisis es fundamental. Debe minimizarse la manipulación manual. [21] La frágil molécula de ARN plantea ciertos desafíos. Como parte del proceso celular de expresión de genes como proteínas, ofrece una medida de la expresión de genes, pero es vulnerable a la hidrólisis y descomposición por enzimas ARNasa siempre presentes . Las muestras pueden congelarse rápidamente en nitrógeno líquido o incubarse en agentes de conservación. [2] ( capítulo 39 )
Debido a que los métodos de diagnóstico molecular pueden detectar marcadores sensibles, estas pruebas son menos intrusivas que una biopsia tradicional . Por ejemplo, debido a que existen ácidos nucleicos libres de células en el plasma humano , una simple muestra de sangre puede ser suficiente para obtener información genética de tumores, trasplantes o de un feto por nacer. [2] ( cap. 45 ) Muchos, pero no todos, los métodos de diagnóstico molecular basados en la detección de ácidos nucleicos utilizan la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para aumentar enormemente el número de moléculas de ácido nucleico, amplificando así la secuencia o secuencias diana en la muestra del paciente. . [2] ( prólogo ) La PCR es un método en el que una plantilla de ADN se amplifica utilizando cebadores sintéticos, una ADN polimerasa y dNTP. La mezcla se cicla entre al menos 2 temperaturas: una temperatura alta para desnaturalizar el ADN bicatenario en moléculas monocatenarias y una temperatura baja para que el cebador se hibride con la plantilla y la polimerasa extienda el cebador. En teoría, cada ciclo de temperatura duplica la cantidad de secuencia objetivo. La detección de variaciones de secuencia usando PCR típicamente implica el diseño y uso de reactivos oligonucleotídicos que amplifican la variante de interés de manera más eficiente que la secuencia de tipo salvaje. La PCR es actualmente el método más utilizado para la detección de secuencias de ADN. [22] La detección del marcador podría utilizar PCR en tiempo real, secuenciación directa, [2] ( cap. 17 ) chips de microarrays, chips prefabricados que prueban muchos marcadores a la vez, [2] ( cap. 24 ) o MALDI-TOF [23] El mismo principio se aplica al proteoma y al genoma . Las matrices de proteínas de alto rendimiento pueden usar ADN o anticuerpos complementarios para unirse y, por lo tanto, pueden detectar muchas proteínas diferentes en paralelo. [24] Las pruebas de diagnóstico molecular varían ampliamente en sensibilidad, tiempo de respuesta, costo, cobertura y aprobación regulatoria. También varían en el nivel de validación aplicado en los laboratorios que los utilizan. Por lo tanto, se requiere una validación local sólida de acuerdo con los requisitos reglamentarios y el uso de controles apropiados, especialmente cuando el resultado puede usarse para informar la decisión de un tratamiento del paciente. [25]
Beneficios
Prenatal
Las pruebas prenatales convencionales para detectar anomalías cromosómicas , como el síndrome de Down, se basan en analizar el número y la apariencia de los cromosomas: el cariotipo . Las pruebas de diagnóstico molecular, como la hibridación genómica comparativa de microarrays, prueban una muestra de ADN en su lugar, y debido al ADN libre de células en el plasma, podrían ser menos invasivas, pero a partir de 2013 sigue siendo un complemento de las pruebas convencionales. [26]
Tratamiento
Algunos de los polimorfismos de un solo nucleótido de un paciente ( ligeras diferencias en su ADN) pueden ayudar a predecir la rapidez con la que metabolizarán determinados fármacos; esto se llama farmacogenómica . [27] Por ejemplo, la enzima CYP2C19 metaboliza varios fármacos, como el agente anticoagulante Clopidogrel , en sus formas activas. Algunos pacientes poseen polimorfismos en lugares específicos del gen 2C19 que producen metabolizadores lentos de esos fármacos; los médicos pueden probar estos polimorfismos y averiguar si los medicamentos serán completamente efectivos para ese paciente. [28] Los avances en biología molecular han ayudado a demostrar que algunos síndromes que antes se clasificaban como una sola enfermedad son en realidad múltiples subtipos con causas y tratamientos completamente diferentes. El diagnóstico molecular puede ayudar a diagnosticar el subtipo, por ejemplo, de infecciones y cánceres, o el análisis genético de una enfermedad con un componente hereditario, como el síndrome de Silver-Russell . [1] [29]
Enfermedad infecciosa
Los diagnósticos moleculares se utilizan para identificar enfermedades infecciosas tales como la clamidia , [30] influenza virus [31] y tuberculosis ; [32] o cepas específicas como el virus H1N1 [33] o el SARS-CoV-2 . [34] La identificación genética puede ser rápida; por ejemplo, una prueba de amplificación isotérmica mediada por bucle diagnostica el parásito de la malaria y es lo suficientemente resistente para los países en desarrollo. [35] Pero a pesar de estos avances en el análisis del genoma, en 2013 las infecciones aún se identifican con más frecuencia por otros medios: su proteoma, bacteriófago o perfil cromatográfico . [36] Los diagnósticos moleculares también se utilizan para comprender la cepa específica del patógeno, por ejemplo, al detectar qué genes de resistencia a los medicamentos posee y, por lo tanto, qué terapias evitar. [36] Además, se pueden implementar ensayos basados en la secuenciación metagenómica de próxima generación para identificar organismos patógenos sin sesgos. [37]
Manejo del riesgo de enfermedades
El genoma de un paciente puede incluir una mutación hereditaria o aleatoria que afecta la probabilidad de desarrollar una enfermedad en el futuro. [27] Por ejemplo, el síndrome de Lynch es una enfermedad genética que predispone a los pacientes a cánceres colorrectales y de otro tipo; La detección temprana puede conducir a un seguimiento estrecho que mejora las posibilidades de que el paciente tenga un buen resultado. [38] El riesgo cardiovascular está indicado por marcadores biológicos y la detección puede medir el riesgo de que un niño nazca con una enfermedad genética como la fibrosis quística . [39] Las pruebas genéticas son éticamente complejas: los pacientes pueden no querer el estrés de conocer su riesgo. [40] En países sin asistencia sanitaria universal, un riesgo conocido puede aumentar las primas de seguro. [41]
Cáncer
El cáncer es un cambio en los procesos celulares que hace que un tumor crezca sin control. [27] Las células cancerosas a veces tienen mutaciones en oncogenes , como KRAS y CTNNB1 (β-catenina). [42] El análisis de la firma molecular de las células cancerosas (el ADN y sus niveles de expresión a través del ARN mensajero) permite a los médicos caracterizar el cáncer y elegir la mejor terapia para sus pacientes. [27] A partir de 2010, los ensayos que incorporan una serie de anticuerpos contra moléculas marcadoras de proteínas específicas son una tecnología emergente; hay esperanzas para estos ensayos multiplex que podrían medir muchos marcadores a la vez. [43] Otros posibles biomarcadores futuros incluyen micro moléculas de ARN , cuyas células cancerosas expresan más que las sanas. [44]
El cáncer es una enfermedad con excesivas causas moleculares y evolución constante. También hay heterogeneidad de enfermedades incluso en un individuo. Los estudios moleculares del cáncer han demostrado la importancia de las mutaciones impulsoras en el crecimiento y la metástasis de los tumores. [45] Se han desarrollado muchas tecnologías para la detección de variaciones de secuencia para la investigación del cáncer. Estas tecnologías generalmente se pueden agrupar en tres enfoques: reacción en cadena de la polimerasa (PCR), hibridación y secuenciación de próxima generación (NGS). [22] Actualmente, la FDA ha aprobado muchos ensayos de PCR e hibridación como diagnósticos in vitro. [46] Sin embargo, los ensayos de NGS aún se encuentran en una etapa temprana en el diagnóstico clínico. [47]
Para realizar la prueba de diagnóstico molecular del cáncer, uno de los problemas más importantes es la detección de la variación de la secuencia de ADN. Las muestras de biopsia tumoral utilizadas para el diagnóstico siempre contienen tan solo un 5% de la variante diana en comparación con la secuencia de tipo salvaje. Además, para aplicaciones no invasivas de sangre periférica u orina, la prueba de ADN debe ser lo suficientemente específica para detectar mutaciones en frecuencias de alelos variantes inferiores al 0,1%. [22]
Actualmente, al optimizar la PCR tradicional, existe una nueva invención, el sistema de mutación refractaria a la amplificación (ARMS) es un método para detectar variantes de secuencias de ADN en el cáncer. El principio detrás de ARMS es que la actividad de extensión enzimática de las ADN polimerasas es muy sensible a los desajustes cerca del extremo 3 'del cebador. [22] Muchas empresas diferentes han desarrollado pruebas de diagnóstico basadas en cebadores ARMS PCR. Por ejemplo, Qiagen therascreen, [48] Roche cobas [49] y Biomerieux THxID [50] han desarrollado pruebas de PCR aprobadas por la FDA para detectar mutaciones de cáncer de pulmón, colon y melanoma metastásico en los genes KRAS, EGFR y BRAF. Sus kits de IVD se validaron básicamente con ADN genómico extraído de tejido FFPE.
También hay microarrays que utilizan un mecanismo de hibridación para hacer diagnósticos de cáncer. Se pueden sintetizar más de un millón de sondas diferentes en una matriz con la tecnología Genechip de Affymetrix con un límite de detección de una a diez copias de ARNm por pocillo. [22] Se suele considerar que los microarrays optimizados producen una cuantificación relativa repetible de diferentes objetivos. [51] Actualmente, la FDA ya ha aprobado una serie de ensayos de diagnóstico que utilizan microarrays: los ensayos MammaPrint de Agendia pueden informar el riesgo de recurrencia del cáncer de mama al perfilar la expresión de 70 genes relacionados con el cáncer de mama; [52] El ensayo autogenómico INFNITI CYP2C19 puede perfilar polimorfismos genéticos, cuyo impacto en la respuesta terapéutica a los antidepresivos es grande; [53] y CytoScan Dx de Affymetrix pueden evaluar las discapacidades intelectuales y los trastornos congénitos mediante el análisis de la mutación cromosómica. [54]
En el futuro, las herramientas de diagnóstico para el cáncer probablemente se centrarán en la secuenciación de próxima generación (NGS). Al utilizar la secuenciación de ADN y ARN para realizar diagnósticos de cáncer, se desarrollará mejor la tecnología en el campo de las herramientas de diagnóstico molecular. Aunque el rendimiento y el precio de NGS se han reducido drásticamente en los últimos 10 años en aproximadamente 100 veces, nos quedan al menos 6 órdenes de magnitud para realizar una secuenciación profunda a nivel del genoma completo. [55] Actualmente, Ion Torrent desarrolló algunos paneles NGS basados en AmpliSeq traslacional, por ejemplo, el Ensayo Integral Oncomine. [56] Se están centrando en utilizar la secuenciación profunda de genes relacionados con el cáncer para detectar variantes raras de secuencias. Las ventajas de NGS son un consumo reducido de reactivos y microambientes altamente controlados, especialmente cuando se combina con dispositivos de microfluidos. [57]
La herramienta de diagnóstico molecular se puede utilizar para la evaluación del riesgo de cáncer. Por ejemplo, la prueba BRCA1 / 2 de Myriad Genetics evalúa el riesgo de cáncer de mama de por vida de las mujeres. [22] Además, algunos cánceres no siempre se emplean con síntomas claros. Es útil analizar a las personas cuando no muestran síntomas obvios y, por lo tanto, pueden detectar el cáncer en etapas tempranas. Por ejemplo, la prueba ColoGuard puede usarse para detectar cáncer colorrectal en personas mayores de 55 años . [58] El cáncer es una enfermedad de larga duración con varios pasos de progresión, las herramientas de diagnóstico molecular se pueden utilizar para el pronóstico de la progresión del cáncer. Por ejemplo, la prueba OncoType Dx de Genomic Health puede estimar el riesgo de cáncer de mama. Su tecnología puede informar a los pacientes para que busquen quimioterapia cuando sea necesario mediante el examen de los niveles de expresión de ARN en el tejido de la biopsia de cáncer de mama. [59]
Con el creciente apoyo del gobierno en el diagnóstico molecular de ADN, se espera que pronto esté disponible un número cada vez mayor de ensayos clínicos de detección de ADN para cánceres. Actualmente, la investigación en el diagnóstico del cáncer se está desarrollando rápidamente con objetivos de menor costo, menor consumo de tiempo y métodos más simples para médicos y pacientes.
Ver también
- Medicina molecular (el campo más amplio de la comprensión molecular de la enfermedad)
- Patología molecular
- Prueba desarrollada en laboratorio
- Patogénesis
- Patogenómica
- Patología
- Medicina de precisión
- Medicina personalizada
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