La electroforesis en gel bidimensional , abreviada como electroforesis 2-DE o 2-D , es una forma de electroforesis en gel comúnmente utilizada para analizar proteínas . Las mezclas de proteínas están separadas por dos propiedades en dos dimensiones en geles 2D. El 2-DE fue introducido por primera vez de forma independiente por O'Farrell [1] y Klose [2] en 1975.
Base para la separación
La electroforesis 2-D comienza con la electroforesis en la primera dimensión y luego separa las moléculas perpendicularmente de la primera para crear un electroferograma en la segunda dimensión. En la electroforesis en la primera dimensión, las moléculas se separan linealmente según su punto isoeléctrico. En la segunda dimensión, las moléculas se separan a 90 grados del primer electroferograma de acuerdo con la masa molecular. Dado que es poco probable que dos moléculas sean similares en dos propiedades distintas, las moléculas se separan más eficazmente en la electroforesis 2-D que en la electroforesis 1-D.
Las dos dimensiones en las que se separan las proteínas mediante esta técnica pueden ser el punto isoeléctrico , la masa del complejo proteico en estado nativo o la masa proteica .
La separación de las proteínas por punto isoeléctrico se denomina enfoque isoeléctrico (IEF). De ese modo, se aplica un gradiente de pH a un gel y se aplica un potencial eléctrico a través del gel, lo que hace que un extremo sea más positivo que el otro. En todos los valores de pH que no sean su punto isoeléctrico, se cargarán las proteínas. Si están cargados positivamente, serán empujados hacia el extremo más negativo del gel y si están cargados negativamente serán empujados hacia el extremo más positivo del gel. Las proteínas aplicadas en la primera dimensión se moverán a lo largo del gel y se acumularán en su punto isoeléctrico; es decir, el punto en el que la carga total de la proteína es 0 (una carga neutra).
Para el análisis del funcionamiento de las proteínas en una célula , el conocimiento de su cooperación es fundamental. La mayoría de las veces, las proteínas actúan juntas en complejos para ser completamente funcionales. El análisis de esta sub orgánulo organización de la célula requiere técnicas de conservación el estado nativo de los complejos de proteínas . En la electroforesis en gel de poliacrilamida nativa ( PAGE nativa ), las proteínas permanecen en su estado nativo y se separan en el campo eléctrico siguiendo su masa y la masa de sus complejos, respectivamente. Para obtener una separación por tamaño y no por carga neta, como en IEF, se transfiere una carga adicional a las proteínas mediante el uso de Coomassie Brilliant Blue o dodecil sulfato de litio. Una vez completada la primera dimensión, los complejos se destruyen aplicando el SDS-PAGE desnaturalizante en la segunda dimensión, donde las proteínas que componen los complejos se separan por su masa.
Antes de separar las proteínas por masa, se tratan con dodecilsulfato de sodio (SDS) junto con otros reactivos ( SDS-PAGE en 1-D). Esto desnaturaliza las proteínas (es decir, las desdobla en moléculas largas y rectas) y une varias moléculas de SDS aproximadamente proporcionales a la longitud de la proteína. Debido a que la longitud de una proteína (cuando se despliega) es aproximadamente proporcional a su masa, esto equivale a decir que une una cantidad de moléculas de SDS aproximadamente proporcional a la masa de la proteína. Dado que las moléculas de SDS están cargadas negativamente, el resultado de esto es que todas las proteínas tendrán aproximadamente la misma proporción de masa a carga que las demás. Además, las proteínas no migrarán cuando no tengan carga (como resultado del paso de enfoque isoeléctrico), por lo tanto, el recubrimiento de la proteína en SDS (con carga negativa) permite la migración de las proteínas en la segunda dimensión (SDS-PAGE, no es compatible para su uso en la primera dimensión a medida que se carga y se necesita usar un detergente no iónico o bipolar). En la segunda dimensión, se aplica nuevamente un potencial eléctrico, pero en un ángulo de 90 grados desde el primer campo. Las proteínas se sentirán atraídas por el lado más positivo del gel (porque el SDS tiene carga negativa) proporcionalmente a su relación masa-carga. Como se explicó anteriormente, esta proporción será casi la misma para todas las proteínas. El progreso de las proteínas se verá frenado por las fuerzas de fricción. Por lo tanto, el gel actúa como un tamiz molecular cuando se aplica la corriente, separando las proteínas en función de su peso molecular, siendo las proteínas más grandes retenidas más arriba en el gel y las proteínas más pequeñas pueden pasar a través del tamiz y alcanzar regiones inferiores del gel .
Detectando proteínas
El resultado de esto es un gel con proteínas esparcidas en su superficie. Estas proteínas pueden detectarse luego por una variedad de medios, pero las tinciones más comúnmente utilizadas son la tinción con plata y azul brillante de Coomassie . En el primer caso, se aplica un coloide de plata al gel. La plata se une a los grupos de cisteína dentro de la proteína. La plata se oscurece por la exposición a la luz ultravioleta. La cantidad de plata puede estar relacionada con la oscuridad y, por lo tanto, con la cantidad de proteína en un lugar determinado del gel. Esta medida solo puede dar cantidades aproximadas, pero es adecuada para la mayoría de los propósitos. La tinción con plata es 100 veces más sensible que Coomassie Brilliant Blue con un rango de linealidad de 40 veces. [3]
Las moléculas distintas de las proteínas pueden separarse mediante electroforesis 2D. En los ensayos de superenrollamiento , el ADN enrollado se separa en la primera dimensión y se desnaturaliza mediante un intercalador de ADN (como el bromuro de etidio o la cloroquina menos cancerígena ) en la segunda. Esto es comparable a la combinación de PAGE / SDS-PAGE nativa en la separación de proteínas.
Técnicas comunes
IPG-DALT
Una técnica común es utilizar un gradiente de pH inmovilizado (IPG) en la primera dimensión. Esta técnica se conoce como IPG-DALT . La muestra se separa primero en gel IPG (que está disponible comercialmente) luego el gel se corta en rodajas para cada muestra que luego se equilibra en SDS-mercaptoetanol y se aplica a un gel SDS-PAGE para su resolución en la segunda dimensión. Normalmente, IPG-DALT no se usa para la cuantificación de proteínas debido a la pérdida de componentes de bajo peso molecular durante la transferencia al gel SDS-PAGE. [4]
IEF SDS-PAGE
Software de análisis de gel 2D
En proteómica cuantitativa , estas herramientas analizan principalmente biomarcadores cuantificando proteínas individuales y mostrando la separación entre una o más "manchas" de proteínas en una imagen escaneada de un gel 2-DE. Además, estas herramientas hacen coincidir puntos entre geles de muestras similares para mostrar, por ejemplo, las diferencias proteómicas entre las etapas tempranas y avanzadas de una enfermedad. Los paquetes de software incluyen Delta2D, ImageMaster, Melanie, PDQuest, Progenesis y REDFIN, entre otros. [ cita requerida ] Si bien esta tecnología se utiliza ampliamente, la inteligencia no se ha perfeccionado. Por ejemplo, aunque PDQuest y Progenesis tienden a coincidir en la cuantificación y el análisis de manchas proteicas bien definidas y bien separadas, ofrecen resultados y tendencias de análisis diferentes con manchas menos definidas y menos separadas. [5]
Los desafíos para el análisis automático basado en software incluyen puntos incompletamente separados (superpuestos) (menos definidos y / o separados), puntos débiles / ruido (p. Ej., "Puntos fantasma"), diferencias de funcionamiento entre geles (p. Ej., La proteína migra a diferentes posiciones en diferentes geles), manchas no coincidentes / no detectadas, que conducen a valores perdidos , [6] [7] manchas no coincidentes, errores en la cuantificación (el software puede detectar erróneamente varios puntos distintos como un solo lugar y / o partes de un lugar pueden ser excluidos de la cuantificación), y las diferencias en los algoritmos de software y por lo tanto las tendencias de análisis
Las listas de selección generadas se pueden utilizar para la digestión automatizada en gel de manchas de proteínas y la posterior identificación de las proteínas mediante espectrometría de masas . El análisis de espectrometría de masas puede identificar mediciones de masa precisas junto con la secuenciación de péptidos que van desde 1000 a 4000 unidades de masa atómica. [8] Para obtener una descripción general del enfoque actual para el análisis de software de imágenes de gel 2DE, consulte [9] o. [10]
Ver también
Referencias
- ^ O'Farrell, PH (1975). "Electroforesis bidimensional de proteínas de alta resolución" . J. Biol. Chem . 250 (10): 4007–21. doi : 10.1016 / S0021-9258 (19) 41496-8 . PMC 2874754 . PMID 236308 .
- ^ Klose, J (1975). "Mapeo de proteínas por enfoque isoeléctrico combinado y electroforesis de tejidos de ratón. Un enfoque novedoso para probar mutaciones puntuales inducidas en mamíferos" . Humangenetik . 26 (3): 231–43. doi : 10.1007 / bf00281458 (inactivo el 31 de mayo de 2021). PMID 1093965 .Mantenimiento de CS1: DOI inactivo a partir de mayo de 2021 ( enlace )
- ^ Switzer RC 3rd, Merril CR, Shifrin S (1979). "Una tinción de plata de alta sensibilidad para la detección de proteínas y péptidos en geles de poliacrilamida". Bioquímica analítica . 98 (1): 231–37. doi : 10.1016 / 0003-2697 (79) 90732-2 . PMID 94518 .CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
- ^ Mikkelsen, Susan; Cortón, Eduardo (2004). Química bioanalítica . John Wiley & Sons, Inc. pág. 224 . ISBN 978-0-471-62386-1.
- ^ Arora PS, Yamagiwa H, Srivastava A, Bolander ME, Sarkar G (2005). "Evaluación comparativa de dos aplicaciones de software de análisis de imagen de electroforesis en gel bidimensional utilizando fluidos sinoviales de pacientes con enfermedad articular". J Orthop Sci . 10 (2): 160–66. doi : 10.1007 / s00776-004-0878-0 . PMID 15815863 . S2CID 45193214 .
- ^ Pedreschi R, Hertog ML, Carpentier SC, et al. (Abril de 2008). "Tratamiento de valores perdidos para análisis estadístico multivariante de datos de proteómica basados en gel". Proteómica . 8 (7): 1371–83. doi : 10.1002 / pmic.200700975 . hdl : 1942/8262 . PMID 18383008 . S2CID 21152053 .
- ^ ¿Qué son los valores perdidos y por qué son un problema?
- ^ Lepedda, Antonio J y Marilena Formato. "Aplicaciones de la tecnología de electroforesis bidimensional al estudio de la aterosclerosis". EJIFCC vol. 19,3 146-59. 20 de diciembre de 2008
- ^ Berth M, Moser FM, Kolbe M, Bernhardt J (octubre de 2007). "El estado del arte en el análisis de imágenes bidimensionales de electroforesis en gel" . Apl. Microbiol. Biotechnol . 76 (6): 1223–43. doi : 10.1007 / s00253-007-1128-0 . PMC 2279157 . PMID 17713763 .
- ^ Bandow JE, Baker JD, Berth M y col. (Agosto de 2008). "El flujo de trabajo de análisis de imágenes mejorado para geles 2-D permite estudios de proteómica basados en geles 2-D a gran escala: estudio de descubrimiento de biomarcadores de EPOC". Proteómica . 8 (15): 3030–41. doi : 10.1002 / pmic.200701184 . PMID 18618493 . S2CID 206361897 .
enlaces externos
- JVirGel Cree geles 2-D virtuales a partir de datos de secuencia.
- Gel IQ Una herramienta de software de descarga gratuita para evaluar la calidad de los datos de análisis de imágenes de gel 2D.
- Manual de métodos y principios de electroforesis bidimensional