La interacción de la cromatina análisis por Paired-End Tag Secuenciación ( Chia-PET o de Chia-PETS ) es una técnica que incorpora la inmunoprecipitación de cromatina (CHIP), basado en el enriquecimiento, la cromatina de ligamiento por proximidad , Paired-End Etiquetas y de gran procesamiento secuenciación para determinar de novo Interacciones de cromatina de largo alcance en todo el genoma. [1]
Los genes pueden ser regulados por regiones alejadas del promotor, como elementos reguladores, aislantes y elementos de frontera, y sitios de unión al factor de transcripción (TFBS) . Descubrir la interacción entre las regiones reguladoras y las regiones codificadoras de genes es esencial para comprender los mecanismos que gobiernan la regulación de los genes en la salud y la enfermedad (Maston et al., 2006). ChIA-PET se puede utilizar para identificar interacciones de cromatina funcionales únicas entre los sitios de unión al factor de transcripción reguladores distales y proximales y los promotores de los genes con los que interactúan.
ChIA-PET también se puede utilizar para desentrañar los mecanismos de control del genoma durante procesos como la diferenciación celular , la proliferación y el desarrollo . Al crear mapas de interactoma ChIA-PET para las proteínas reguladoras de unión al ADN y las regiones promotoras , podemos identificar mejor dianas únicas para la intervención terapéutica (Fullwood y Yijun, 2009).
Metodología
El método ChIA-PET combina métodos basados en ChIP (Kuo & Allis, 1999) y captura de conformación cromosómica (3C), para ampliar las capacidades de ambos enfoques. La secuenciación de ChIP (ChIP-Seq) es un método popular utilizado para identificar TFBS, mientras que 3C se ha utilizado para identificar interacciones de cromatina de largo alcance (Dekker et al., 2002). Sin embargo, ambos sufren limitaciones cuando se utilizan de forma independiente para identificar interacciones de novo de largo alcance en todo el genoma. Si bien ChIP-Seq se usa generalmente para la identificación de TFBS en todo el genoma (Barski et al., 2007; Wei et al., 2006), solo proporciona información lineal de los sitios de unión de proteínas a lo largo de los cromosomas (pero no interacciones entre ellos), y puede sufrir un elevado ruido de fondo genómico (falsos positivos).
Si bien 3C es capaz de analizar interacciones de cromatina de largo alcance, no se puede usar en todo el genoma y, como ChIP-Seq, también sufre altos niveles de ruido de fondo. Dado que el ruido aumenta en relación con la distancia entre las regiones que interactúan (máximo 100 kb), se requieren controles laboriosos y tediosos para una caracterización precisa de las interacciones de la cromatina (Dekker et al., 2006).
El método ChIA-PET resuelve con éxito los problemas del ruido de interacción no específico que se encuentra en ChIP-Seq mediante la sonicación de los fragmentos de ChIP para separar los adjuntos aleatorios de los complejos de interacción específicos. El siguiente paso, que se conoce como enriquecimiento, reduce la complejidad para el análisis de todo el genoma y agrega especificidad a las interacciones de cromatina unidas por TF (factores de transcripción) predeterminados. La capacidad de los enfoques 3C para identificar interacciones de largo alcance se basa en la teoría de la ligadura de proximidad. En lo que respecta a la interligación de ADN, los fragmentos que están unidos por complejos de proteínas comunes tienen mayores ventajas cinéticas en condiciones diluidas que los que se difunden libremente en solución o se anclan en diferentes complejos. ChIA-PET aprovecha este concepto incorporando secuencias enlazadoras en los extremos libres de los fragmentos de ADN atados a los complejos de proteínas. Para construir la conectividad de los fragmentos atados por complejos reguladores, las secuencias enlazadoras se ligan durante la ligadura de proximidad nuclear. Por lo tanto, los productos de la ligadura conectada al enlazador pueden analizarse mediante secuenciación de PET de rendimiento ultra alto y mapearse en el genoma de referencia . Dado que ChIA-PET no depende de sitios específicos para la detección como lo son 3C y 4C, permite la detección de novo imparcial de las interacciones de la cromatina en todo el genoma (Fullwood et al., 2009).
Flujo de trabajo
Parte del flujo de trabajo de laboratorio húmedo:
- El formaldehído se usa para reticular los complejos de ADN-proteína. La sonicación se utiliza para romper la cromatina y también para reducir interacciones no específicas.
- Se utiliza un anticuerpo específico de elección para enriquecer los fragmentos de cromatina unidos a proteínas de interés. El material de chip unido por el anticuerpo se usa para construir el ChIA-PET.
- Figura 1. Se utilizan semiengarces de oligonucleótidos biotinilados que contienen sitios MmeI flanqueantes para conectar fragmentos de ADN ligados por proximidad. Se diseñan dos enlazadores diferentes (A y B) con códigos de barras de nucleótidos específicos (CG o AT) para cada una de las dos secuencias enlazadoras (esto permitirá la identificación del producto de ligación quimérico como se describe en la Figura 5).
- Figura 2. Los enlazadores se ligan a los fragmentos de ADN atados.
- Figura 3. Los fragmentos de conector se ligan en las perlas de ChIP en condiciones de dilución. Luego, el ADN purificado es digerido por MmeI, que corta a una distancia de su sitio de reconocimiento para liberar la estructura etiqueta-enlazador-etiqueta.
- Figura 4. A continuación, los PET biotinilados se inmovilizan en perlas magnéticas conjugadas con estreptavidina.
- Figura 5. Las secuencias de PET con composición de código de barras de enlazador AA (CG / CG) y BB (AT / AT) se consideran posibles productos de ligación intracomplejos, mientras que las secuencias de PET con composición de enlazador AB (CG / AT) se consideran derivado de productos de ligación quimérica entre fragmentos de ADN unidos en diferentes complejos de cromatina.
Parte del flujo de trabajo de laboratorio seco:
Extracción, mapeo y análisis estadísticos de PET
Las etiquetas PET se extraen y se asignan al genoma humano de referencia in silico .
Identificación de picos enriquecidos con ChIP (sitios de unión)
Los PET autoligados se utilizan para identificar sitios enriquecidos con ChIP porque proporcionan el mapeo más confiable (20 + 20 bit / s) al genoma de referencia.
Algoritmo de búsqueda de picos de enriquecimiento de ChIP
Un pico llamado se considera un sitio de unión si hay múltiples PET autoligadas superpuestas. La tasa de descubrimiento falso (FDR) se determina mediante simulaciones estadísticas para estimar el fondo aleatorio de superposiciones de ADN virtual derivado de PET y el ruido de fondo estimado.
Filtrado de ADN repetitivo (afecta la unión no específica)
Se eliminan las regiones satélite y los sitios de unión presentes en regiones con variaciones estructurales severas.
Recuento de enriquecimiento de ChIP
Los números de PET de autoligación e interligación (dentro de una ventana de + 250 pb) se informa en cada sitio. El número total de PET autoligadas e interligadas en un sitio específico se denomina recuento de enriquecimiento de ChIP.
Figura 6. Clasificación de PET: las secuencias de PET alineadas de forma única se pueden clasificar según se deriven de un fragmento de ADN o de dos fragmentos de ADN.
- PET de autoligado
Si las dos etiquetas de un PET se mapean en el mismo cromosoma con el intervalo genómico en el rango de fragmentos de ADN de ChIP (menos de 3 Kb), con la orientación de autoligado esperada y en la misma hebra, se considera que se derivan de una autoligación de un solo fragmento de ADN de ChIP, y se considera una PET de autoligación.
- PET entre ligadura
Si un PET no se ajusta a estos criterios, lo más probable es que el PET sea el resultado de un producto de ligación entre dos fragmentos de ADN y se lo denomine PET entre ligaduras. Las dos etiquetas de un PET entrelazado no tienen orientaciones de etiquetas fijas, es posible que no se encuentren en las mismas hebras, pueden tener algún intervalo genómico y es posible que no se mapeen en el mismo cromosoma.
- PET con ligadura intracromosómica
Si las dos etiquetas de una PET entre ligadura están mapeadas en el mismo cromosoma pero con un intervalo> 3 Kb en cualquier orientación, estas PET se denominan PET de interconexión intracromosómica.
- PET de ligadura intercromosómica
Los PET que se asignan a diferentes cromosomas se denominan PET de interligación intercromosómica.
Figura 7. Mecanismo propuesto que muestra cómo los elementos reguladores distales pueden iniciar interacciones de cromatina de largo alcance que implican regiones promotoras de genes diana.
Las interacciones forman estructuras de bucle de ADN con múltiples TFBS en el centro de anclaje. Los bucles pequeños podrían empaquetar genes cerca del centro de anclaje en un subcompartimento estrecho, lo que podría aumentar la concentración local de proteínas reguladoras para mejorar la activación transcripcional. Este mecanismo también podría mejorar la eficiencia de la transcripción, permitiendo que el ARN pol II realice un ciclo de las plantillas génicas circulares estrechas. Es más probable que los bucles de interacción grandes unan genes distantes en cualquier extremo del bucle que residen cerca de los sitios de anclaje para una regulación coordinada, o podrían separar genes en bucles largos para evitar su activación. Adaptado de Fullwood et al. (2009).
Fortalezas y debilidades
Ventajas del método ChIA-PET
- ChIA-PET tiene el potencial de ser un enfoque imparcial, de genoma completo y de novo para el análisis de interacción de cromatina de largo alcance (Fullwood y Yijun, 2009).
- Un experimento de ChIA-PET es capaz de proporcionar dos conjuntos de datos globales: los sitios de unión del factor proteico (PET autoligados); y las interacciones entre los sitios de unión (PET interconectados).
- ChIA-PET implica ChIP para reducir la complejidad del análisis de todo el genoma y añade especificidad a las interacciones de la cromatina unidas por factores de interés específicos.
- ChIA-PET es compatible con enfoques de secuenciación de próxima generación basados en etiquetas, como la pirosecuenciación Roche 454, Illumina GA, ABI SOLiD y Helicos.
- ChIA-PET es aplicable a muchos factores proteicos diferentes implicados en la regulación transcripcional o la conformación estructural de la cromatina.
- El análisis de ChIA-PET se puede aplicar a las interacciones de la cromatina involucradas en un proceso nuclear particular. Mediante el uso de TF generales como la ARN polimerasa II, puede ser posible identificar todas las interacciones de cromatina implicadas en la regulación de la transcripción. Además, el uso de factores proteicos implicados en la replicación del ADN o la estructura de la cromatina permitiría la identificación de todas las interacciones debidas a la replicación del ADN y la modificación estructural de la cromatina (Fullwood et al., 2009).
Debilidades
- Está bien establecido que los complejos reguladores cis y trans contienen combinaciones únicas de proteínas basadas en condiciones específicas de células y tejidos (Dekker et al., 2006). Si bien la identificación de TFBS funcional único es un avance significativo, el uso de ChIA-PET para identificar proteínas individuales en un complejo requeriría conjeturas y múltiples experimentos para identificar cada proteína que interactúa. Este sería un esfuerzo costoso y que requeriría mucho tiempo.
- ChIA-PET está limitado por la calidad, pureza y especificidad de los anticuerpos utilizados (Fullwood et al., 2009).
- ChIA-PET depende de la identificación de secuencias que pueden mapearse en la secuencia de referencia (ref).
- ChIA-PET requiere el uso de algoritmos informáticos de llamada de picos para organizar y mapear las lecturas de PET al genoma de referencia. Debido a las variaciones entre las plataformas de software, los resultados pueden variar según el programa que se utilice.
- Aunque las regiones de ADN repetitivas pueden asociarse con la regulación de genes (Polak y Domany, 2006), deben eliminarse ya que pueden afectar los datos (Fullwood et al., 2009).
Historia
Fullwood y col. (2009), utilizaron ChIA-PET para detectar y mapear la red de interacción de la cromatina mediada por el receptor de estrógeno alfa (ER-alfa) en células cancerosas humanas. El mapa de interactoma de cromatina global resultante reveló que los sitios de unión a ER-alfa remotos también estaban anclados a los promotores de genes a través de interacciones de cromatina de largo alcance, lo que sugiere que ER-alfa funciona mediante un extenso bucle de cromatina para unir genes para una regulación transcripcional coordinada.
Análisis y software
Software que se utiliza normalmente en un experimento ChIA-PET
ELANDO
Asigna fragmentos de ADN enriquecidos con ChIP al genoma humano de referencia. [1]
RepeatMasker
Enmascaramiento in silico de elementos repetitivos. [2]
simulación del Monte Carlo
Se utiliza para estimar las tasas de falsos descubrimientos. [2]
PET-herramienta
Un paquete de software para el procesamiento y la gestión de datos de secuencia de etiquetas di-Tag Paired-End. [3]
Herramienta ChIA-PET
Un paquete de software para procesar datos ChIA-PET. Sitio web de la herramienta ChIA-PET Papel de la herramienta ChIA-PET
Alternativas
Inmunoprecipitación de cromatina:
ChIP-Seq , ChIP-PET , ChIP-SAGE , ChIP-CHIP .
Captura de conformación cromosómica :
2-C, 3-C, 4-C, 5-C.
Etiquetas de extremo emparejado:
PET .
Referencias
- ^ Fullwood, Melissa J .; Ruan, Yijun (1 de mayo de 2009). "Métodos basados en chips para la identificación de interacciones de cromatina de largo alcance" . Revista de bioquímica celular . 107 (1): 30–39. doi : 10.1002 / jcb.22116 . ISSN 1097-4644 . PMC 2748757 . PMID 19247990 .
- ^ Método de Monte Carlo
- Barski y col., (2007). Perfiles de alta resolución de metilaciones de histonas en el genoma humano. Célula. (129); 823–37.
- Dekker, (2002). Captura de la conformación cromosómica. Ciencias. (295); 1306-1311.
- Dekker, (2006). Las tres 'C' de la captura de la conformación cromosómica: controles, controles, controles. Nat. Métodos. (3); 17-21.
- Fullwood y col., (2009). Un interactoma de cromatina humana unido al receptor α de estrógeno. Naturaleza. (462); 58–64.
- Fullwood y Yijun, (2009). Métodos basados en chips para la identificación de interacciones de cromatina de largo alcance. J Cell Biochem. 107 (1); 30–39.
- Johnson y col., (2007). Mapeo de todo el genoma de interacciones proteína-ADN in vivo. Ciencias. (316); 1497–502.
- Kuo y Allis, (1999). Reticulación e inmunoprecipitación in vivo para el estudio de asociaciones dinámicas de proteína: ADN en un entorno de cromatina. Métodos. (19); 425–33.
- Li, G., Fullwood, MJ, Xu, H., Mulawadi, FH, Velkov, S., Vega, V., Ariyaratne, PN, Mohamed, YB, Ooi, HS, Tennakoon, C., Wei, CL, Ruan , Y. y Sung, herramienta WK ChIA-PET para un análisis integral de la interacción de la cromatina con secuenciación de etiquetas de extremos emparejados. Biol del genoma, 11 (2). R22.
- Maston y col., (2006). Elementos reguladores de la transcripción en el genoma humano. Annu. Rev: Genómica. Hum Genet. (7); 29–59.
- Polak y Domany, (2006). Los elementos Alu contienen muchos sitios de unión para factores de transcripción y pueden desempeñar un papel en la regulación de los procesos de desarrollo. BMC Genomics. (7); 133.
- Wei y col., (2006). Un mapa global de los sitios de unión del factor de transcripción de p53 en el genoma humano. Célula. (124); 207-19.
enlaces externos
- Navegador del genoma ChIA-PET : este navegador es para ver los datos de Fullwood et al. (2009), e incluye un visor de interacción del genoma completo personalizado que proporciona una imagen macroscópica de los sitios de unión y las interacciones junto con un panorama genómico completo.