La electroforesis de proteínas es un método para analizar las proteínas en un líquido o extracto. La electroforesis se puede realizar con un pequeño volumen de muestra de varias formas alternativas con o sin un medio de soporte: electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (en resumen: electroforesis en gel, PAGE o electroforesis SDS), electroforesis de flujo libre , electroforesis , isotacoforesis , electroforesis de afinidad , inmunoelectroforesis , contraelectroforesis y electroforesis capilar . Cada método tiene muchas variaciones con ventajas y limitaciones individuales. Electroforesis en gela menudo se realiza en combinación con inmunotransferencia de electrotransferencia para proporcionar información adicional sobre una proteína específica. Debido a limitaciones prácticas, la electroforesis de proteínas generalmente no es adecuada como método preparativo. [ aclaración necesaria ]
Métodos de gel desnaturalizante
SDS-PAGE
SDS-PAGE, electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio , describe una colección de técnicas relacionadas para separar proteínas de acuerdo con su movilidad electroforética (una función del peso molecular de una cadena polipeptídica) mientras se encuentran en el estado desnaturalizado (desplegado). En la mayoría de las proteínas, la unión de SDS a la cadena polipeptídica imparte una distribución uniforme de carga por unidad de masa, lo que da como resultado un fraccionamiento por tamaño aproximado durante la electroforesis.
El SDS es un agente detergente fuerte que se usa para desnaturalizar las proteínas nativas en polipéptidos individuales desplegados . Cuando una mezcla de proteínas se calienta a 100 ° C en presencia de SDS, el detergente envuelve la estructura polipeptídica. En este proceso, las cargas intrínsecas de los polipéptidos se vuelven insignificantes en comparación con las cargas negativas aportadas por SDS. Por tanto, los polipéptidos después del tratamiento se convierten en estructuras en forma de varilla que poseen una densidad de carga uniforme, que es la misma carga negativa neta por unidad de longitud. Las movilidades electroforéticas de estas proteínas serán una función lineal de los logaritmos de sus pesos moleculares.
Métodos nativos de gel
Los geles nativos, también conocidos como geles no desnaturalizantes, analizan proteínas que todavía están en su estado plegado. Por lo tanto, la movilidad electroforética depende no solo de la relación carga-masa, sino también de la forma física y el tamaño de la proteína.
PÁGINA nativa azul
BN-PAGE es una técnica de PAGE nativa , donde el colorante Coomassie Brilliant Blue proporciona las cargas necesarias a los complejos de proteínas para la separación electroforética. [1] [2] La desventaja de Coomassie es que, al unirse a las proteínas, puede actuar como un detergente provocando la disociación de los complejos . Otro inconveniente es la posible extinción de la quimioluminiscencia (por ejemplo, en ensayos de actividad o detección de transferencia Western posteriores ) o la fluorescencia de proteínas con grupos protésicos (por ejemplo, hemo o clorofila ) o marcadas con tintes fluorescentes.
PÁGINA nativa clara
CN-PAGE (comúnmente conocido como Native PAGE) separa proteínas ácidas solubles en agua y de membrana en un gel de gradiente de poliacrilamida . No utiliza colorante cargado, por lo que la movilidad electroforética de las proteínas en CN-PAGE (en contraste con la técnica de cambio de carga BN-PAGE) está relacionada con la carga intrínseca de las proteínas. [3] La distancia de migración depende de la carga de la proteína, su tamaño y el tamaño de los poros del gel. En muchos casos, este método tiene una resolución más baja que BN-PAGE, pero CN-PAGE ofrece ventajas siempre que el colorante Coomassie interfiera con otras técnicas analíticas, por ejemplo, se ha descrito como una técnica de separación a microescala muy eficiente para análisis FRET . [4] Además, CN-PAGE es más suave que BN-PAGE, por lo que puede retener conjuntos supramoleculares lábiles de complejos de proteínas de membrana que se disocian en las condiciones de BN-PAGE.
PÁGINA nativa cuantitativa
Los complejos de proteínas plegadas de interés se separan de forma limpia y predecible debido a las propiedades específicas del gel de poliacrilamida. Las proteínas separadas se eluyen continuamente en un eluyente fisiológico y se transportan a un recolector de fracciones. En cuatro a cinco fracciones de PAGE, cada uno de los cofactores metálicos se puede identificar y cuantificar absolutamente mediante ICP-MS de alta resolución . Las estructuras respectivas de las metaloproteínas aisladas se pueden determinar mediante espectroscopía de RMN en solución . [5]
Sistemas tampón
La mayoría de las separaciones de proteínas se realizan utilizando un sistema tampón "discontinuo" (o DISC) que mejora significativamente la nitidez de las bandas dentro del gel. Durante la electroforesis en un sistema de gel discontinuo, se forma un gradiente de iones en la etapa inicial de la electroforesis que hace que todas las proteínas se enfoquen en una sola banda nítida. La formación del gradiente de iones se logra eligiendo un valor de pH en el que los iones del tampón se cargan solo moderadamente en comparación con las proteínas recubiertas con SDS. Estas condiciones proporcionan un entorno en el que las reacciones de Kohlrausch determinan la conductividad molar . Como resultado, las proteínas recubiertas de SDS se concentran varias veces en una zona delgada del orden de 19 μm en unos pocos minutos. En esta etapa, todas las proteínas migran a la misma velocidad de migración por isotacoforesis . Esto ocurre en una región del gel que tiene poros más grandes para que la matriz del gel no retarde la migración durante el evento de enfoque o "apilamiento". [6] [7] La separación de las proteínas por tamaño se logra en la región inferior de "resolución" del gel. El gel de resolución normalmente tiene un tamaño de poro mucho más pequeño, lo que conduce a un efecto de tamizado que ahora determina la movilidad electroforética de las proteínas. Al mismo tiempo, la parte de separación del gel también tiene un valor de pH en el que los iones tampón llevan en promedio una carga mayor, lo que hace que "superen" las proteínas cubiertas con SDS y eliminen el gradiente iónico y por lo tanto el efecto de apilamiento.
Un sistema tampón discontinuo muy extendido es el sistema de tris-glicina o " Laemmli " que se apila a un pH de 6,8 y se resuelve a un pH de ~ 8,3-9,0. Un inconveniente de este sistema es que estos valores de pH pueden promover la formación de enlaces disulfuro entre los residuos de cisteína en las proteínas porque el pKa de la cisteína varía de 8 a 9 y porque el agente reductor presente en el tampón de carga no co-migra con las proteínas. Los avances recientes en la tecnología de amortiguación alivian este problema resolviendo las proteínas a un pH muy por debajo del pKa de la cisteína (p. Ej., Bis-tris , pH 6,5) e incluyen agentes reductores (p. Ej., Bisulfito de sodio) que se mueven hacia el gel antes que las proteínas para mantener un ambiente reductor. Un beneficio adicional de usar tampones con valores de pH más bajos es que el gel de acrilamida es más estable a valores de pH más bajos, por lo que los geles se pueden almacenar durante largos períodos de tiempo antes de su uso. [8] [9]
Electroforesis en gel de gradiente SDS de proteínas
A medida que se aplica voltaje, los aniones (y las moléculas de muestra cargadas negativamente) migran hacia el electrodo positivo (ánodo) en la cámara inferior, el ion principal es Cl - (alta movilidad y alta concentración); el glicinato es el ión de arrastre (baja movilidad y baja concentración). Las partículas de proteína SDS no migran libremente en el límite entre el Cl - del tampón de gel y el Gly - del tampón del cátodo. Friedrich Kohlrausch descubrió que la ley de Ohm también se aplica a los electrolitos disueltos . Debido a la caída de tensión entre el Cl - y glicina-buffers, las proteínas se comprimen (apilados) en capas delgadas micrométricos. [10] El límite se mueve a través de un gradiente de poros y la pila de proteínas se dispersa gradualmente debido a un aumento de la resistencia a la fricción de la matriz de gel. El apilamiento y desapilamiento ocurre continuamente en el gel de gradiente, para cada proteína en una posición diferente. Para un desapilamiento completo de proteínas, la concentración de gel de poliacrilamida debe exceder el 16% T. El sistema de dos geles de "Laemmli" es un gel de gradiente simple. La discontinuidad del pH de los tampones no tiene importancia para la calidad de la separación y no se necesita un "gel de apilamiento" con un pH diferente.
Visualización
La mancha de proteína más popular es Coomassie Brilliant Blue . Es un colorante aniónico, que se une de manera no específica a las proteínas. Las proteínas del gel se fijan con ácido acético y se tiñen simultáneamente. El exceso de tinte incorporado al gel se puede eliminar decolorando con la misma solución sin tinte. Las proteínas se detectan como bandas azules sobre un fondo claro.
Cuando se necesita un método más sensible que la tinción de Coomassie, se suele utilizar la tinción con plata. La tinción con plata es un procedimiento sensible para detectar trazas de proteínas en geles, pero también puede visualizar ácidos nucleicos o polisacáridos.
Los métodos de visualización sin utilizar un tinte como Coomassie y plata están disponibles en el mercado. Por ejemplo, Bio-Rad Laboratories comercializa geles "sin manchas" para electroforesis en gel SDS-PAGE. Alternativamente, se pueden usar tintes fluorescentes reversibles de Azure Biosystems como AzureRed o Azure TotalStain Q.
De manera similar, como en la electroforesis en gel de ácido nucleico, a menudo se usa un colorante de rastreo . Los colorantes aniónicos de movilidad electroforética conocida se incluyen normalmente en el tampón de muestra. Un tinte de rastreo muy común es el azul de bromofenol . Este tinte está coloreado a pH alcalino y neutro y es una pequeña molécula cargada negativamente que se mueve hacia el ánodo. Al ser una molécula de gran movilidad, se adelanta a la mayoría de las proteínas.
Aplicaciones médicas
En medicina , la electroforesis de proteínas es un método para analizar las proteínas principalmente en el suero sanguíneo . Antes del uso generalizado de la electroforesis en gel , la electroforesis de proteínas se realizaba como electroforesis de flujo libre (en papel) o como inmunoelectroforesis.
Tradicionalmente, se consideran dos clases de proteínas sanguíneas : albúmina sérica y globulina . Generalmente son iguales en proporción, pero la albúmina como molécula es mucho más pequeña y tiene una carga levemente negativa, lo que lleva a una acumulación de albúmina en el gel electroforético. Una pequeña banda antes de la albúmina representa la transtiretina (también denominada prealbúmina). Algunas formas de medicamentos o sustancias químicas corporales pueden causar su propia banda, pero por lo general es pequeña. Se observan bandas anormales (picos) en la gammapatía monoclonal de significado indeterminado y el mieloma múltiple , y son útiles en el diagnóstico de estas afecciones.
Las globulinas se clasifican por su patrón de bandas (con sus principales representantes):
- La banda alfa (α) consta de dos partes, 1 y 2:
- α 1 - α 1 -antitripsina , α 1 -glicoproteína ácida.
- α 2 - haptoglobina , α 2 -macroglobulina , α 2 -antiplasmina , ceruloplasmina .
- La banda beta (β): transferrina , LDL , complemento
- La banda gamma (γ) - inmunoglobulina (IgA, IgD, IgE, IgG e IgM). Las paraproteínas (en el mieloma múltiple) suelen aparecer en esta banda.
El procedimiento médico actual normal implica la determinación de numerosas proteínas en el plasma, incluidas hormonas y enzimas, algunas de ellas también determinadas por electroforesis. Sin embargo, la electroforesis en gel es principalmente una herramienta de investigación, también cuando se trata de proteínas sanguíneas.
Ver también
- Electroforesis de afinidad
- Electrotransferencia
- Electroenfoque
- Electroforesis en gel de poliacrilamida, PAGE o electroforesis en gel
- Inmunoelectroforesis
- Inmunofijación
- SDD-AGE
- Electroforesis en gel nativo
- QPNC-PAGE
- Paraproteína
- Proteólisis rápida paralela (FASTpp) [11]
Referencias
- ^ Schägger, H .; Jagow, G. (1991). "Electroforesis nativa azul para el aislamiento de complejos de proteínas de membrana en forma enzimáticamente activa". Anal. Biochem . 199 (2): 223–231. doi : 10.1016 / 0003-2697 (91) 90094-A . PMID 1812789 .
- ^ Wittig, I .; Braun, HP; Schägger, H. (2006). "PÁGINA nativa azul". Nat. Protocolos . 1 (1): 418–428. doi : 10.1038 / nprot.2006.62 . PMID 17406264 .
- ^ Wittig, I .; Schägger, H. (noviembre de 2005). "Ventajas y limitaciones de Clear-Native PAGE" . Proteómica . 5 (17): 4338–46. doi : 10.1002 / pmic.200500081 . PMID 16220535 . Archivado desde el original el 5 de enero de 2013.
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enlaces externos
- Recurso educativo para la electroforesis de proteínas
- Electroforesis en gel de proteínas