La hemocianina de lapa ojo de cerradura (KLH) es una metaloproteína grande, multisubunitaria, portadora de oxígeno que se encuentra en la hemolinfa de la lapa ojo de cerradura gigante , Megathura crenulata , una especie de lapa ojo de cerradura que vive frente a la costa de California , desde la bahía de Monterey hasta la Isla. Asunción frente a Baja California . [2]
Propiedades proteicas
Hay dos genes de hemocianina de lapa californiana , denominados KLH1 y KLH2, que comparten alrededor del 60% de identidad a nivel de proteínas. Ambos codifican proteínas glicosiladas grandes que constan de alrededor de 3400 aminoácidos y un peso molecular de alrededor de 390,000 Daltons , excluyendo la glicosilación. La proteína se oligomeriza para formar un complejo didecamerico en forma de barril que está compuesto por 20 monómeros. Cada dominio de una subunidad KLH contiene dos átomos de cobre que juntos se unen a una sola molécula de oxígeno (O 2 ). Cuando el oxígeno está unido a la hemocianina, la molécula adquiere un distintivo transparente , opalescente de color azul, debido a la Cu 2+ estado del cobre. En ausencia de oxígeno, el cobre unido se encuentra como Cu 1+ y la hemocianina es incolora. La proteína KLH es potentemente inmunogénica, pero no provoca una respuesta inmunitaria adversa en los seres humanos. Por tanto, es muy apreciada como proteína portadora de vacunas. Debido a su tamaño y glicosilación, la proteína KLH no se puede reproducir sintéticamente; sólo está disponible como producto biológico purificado de la lapa Megathura crenulata .
Purificación
La KLH se purifica a partir de la hemolinfa de Megathura crenulata mediante una serie de pasos que normalmente incluyen precipitación con sulfato de amonio y diálisis, y puede implicar la purificación cromatográfica para obtener la máxima pureza. La purificación de KLH también puede incluir la eliminación de endotoxinas , pero este paso a menudo es innecesario porque la endotoxina sirve como adyuvante cuando se inyecta para la producción de anticuerpos.
Si la proteína se desnaturaliza o si los iones de cobre se pierden en el proceso de purificación, el color azul opalescente desaparece y la solución adquiere un color grisáceo apagado. La desnaturalización de KLH también da como resultado una tendencia de la proteína a agregarse y precipitarse de la solución.
Uso en biotecnología
La hemocianina de lapa californiana (KLH) se utiliza ampliamente como proteína transportadora en la producción de anticuerpos para aplicaciones de investigación, biotecnología y terapéuticas . Los haptenos son sustancias de bajo peso molecular , como péptidos , proteínas pequeñas y moléculas de fármacos, que generalmente no son inmunogénicas y requieren la ayuda de una proteína transportadora para estimular una respuesta del sistema inmunológico en forma de producción de anticuerpos. [3] KLH es la proteína transportadora más utilizada para este propósito. KLH es una proteína transportadora eficaz por varias razones. Su gran tamaño y numerosos epítopos generan una respuesta inmune sustancial, y la abundancia de residuos de lisina para acoplar haptenos permite una alta relación hapteno: proteína portadora, aumentando la probabilidad de generar anticuerpos específicos de hapteno. Además, debido a que KLH se deriva de la lapa, un gasterópodo, está filogenéticamente distante de las proteínas de los mamíferos, lo que reduce los falsos positivos en las técnicas de investigación de base inmunológica en organismos modelo de mamíferos.
KLH también puede ser una molécula desafiante para trabajar debido a su propensión a agregarse y precipitar. Los agregados siguen siendo inmunogénicos, pero limitan la capacidad de conjugar haptenos y son difíciles de manipular en el laboratorio. Una preparación KLH de alta calidad con un color azul opalescente claro es el mejor indicador de la solubilidad de KLH.
Hapten acoplamiento
Haptens se puede acoplar a KLH utilizando varios métodos. Se puede realizar un acoplamiento simple de un paso usando el reticulante de carbodiimida EDC para unir covalentemente carboxilos a aminas primarias. Este método es el más simple de realizar y la orientación "aleatoria" permite la generación de anticuerpos contra todos los epítopos posibles, pero generalmente da como resultado cierto grado de polimerización, lo que disminuye la solubilidad y hace que el conjugado sea más difícil de manipular.
KLH se puede activar con el reticulante Sulfo-SMCC , que convierte los residuos de lisina en grupos maleimida reactivos con sulfhidrilo . A continuación, se puede hacer reaccionar un hapteno que contiene sulfhidrilo con el KLH para completar el inmunógeno sin provocar la polimerización. La especificidad de esta reacción es ideal para situaciones en las que la cisteína se encuentra alejada del epítopo deseado (por ejemplo, en péptidos en los que se puede añadir una cisteína terminal a cualquier extremo del péptido). La KLH activada con maleimida, donde se ha completado la primera parte de este procedimiento de dos pasos, está disponible comercialmente.
Otras proteínas transportadoras
- Concholepas concholepas hemocianina (comercializada como Blue Carrier) [ cita requerida ]
- Albúmina de suero bovino (BSA) [ cita requerida ]
- BSA cationizada (cBSA) [ cita requerida ]
- Ovoalbúmina [ cita requerida ]
Uso en terapia contra el cáncer
KLH se está probando en una variedad de vacunas contra el cáncer , incluido el linfoma no Hodgkin , el melanoma cutáneo , el cáncer de mama y de vejiga. [4] [5] Estas vacunas contienen antígenos específicos asociados a tumores conjugados con KLH para estimular las respuestas inmunitarias antitumorales que pueden destruir las células tumorales.
El creciente interés en las vacunas terapéuticas (es decir, inmunoterapias activas) para el cáncer y la eficacia documentada de KLH como una proteína transportadora superior para las vacunas contra el cáncer están creando un mercado biofarmacéutico significativo para las formulaciones de KLH. [6]
Se han desarrollado ensayos para controlar las respuestas inmunes humorales contra KLH en suero humano para facilitar el uso óptimo de las aplicaciones biomédicas de KLH. [7]
Consideraciones ecologicas
Debido a los usos beneficiosos de KLH, la lapa gigante , de la que se deriva KLH, ha sido un tema de creciente preocupación entre los biólogos pesqueros en el estado de California debido a la posibilidad de sobreexplotación de la especie con fines comerciales. Para empezar, las lapas gigantes no son una especie abundante, [8] y algunos buzos han informado de una disminución en sus poblaciones. [2] En un informe de 2006 del Instituto de Ciencias Marinas de la Universidad de California, Santa Bárbara, los científicos afirman que están "muy preocupados por la pesquería emergente" de lapas gigantes y sugieren que existe la posibilidad de "diezmar sus poblaciones". [9] Para ayudar a garantizar una fuente segura a largo plazo de KLH para los muchos programas de investigación biomédica patrocinados por el gobierno federal que utilizan KLH, las agencias federales, incluidos los Institutos Nacionales de Salud [10] y la Fundación Nacional de Ciencias [11] , también han patrocinado investigaciones para establecer producción de maricultura sostenible de la lapa ojo de cerradura gigante.
Referencias
- ↑ Gatsogiannis, C .; Markl, JR (2009). "Hemocianina de lapa de ojo de cerradura: estructura de 9-Å CryoEM y modelo molecular del Didecamer KLH1 revelan las interfaces y la topología intrincada de las 160 unidades funcionales". Revista de Biología Molecular . 385 (3): 963–983. doi : 10.1016 / j.jmb.2008.10.080 . PMID 19013468 .
- ^ a b "Bucear en seco con el Dr. Bill, 084: lapa de ojo de cerradura gigante" .
- ^ Lateef SS, Gupta S, Jayathilaka LP, Krishnanchettiar S, Huang JS, Lee BS (2007). "Un protocolo mejorado para acoplar péptidos sintéticos a proteínas transportadoras para la producción de anticuerpos utilizando DMF para solubilizar péptidos" . J Biomol Tech . 18 (3): 173–6. PMC 2062551 . PMID 17595313 .
- ^ "Vacunas contra el cáncer" .
- ^ "Base de conocimientos de hemocianina de lapa de ojo de cerradura" .
- ^ Harris JR, Markl J (1999). "Hemocianina de lapa ojo de cerradura (KLH): una revisión biomédica". Micron . 30 (6): 597–623. PMID 10544506 .
- ^ Aarntzen EH, de Vries, IJ, Goertz JH; et al. (Noviembre 2012). "Las respuestas humorales anti-KLH en pacientes con cáncer tratados con inmunoterapia basada en células dendríticas están dictadas por diferentes parámetros de vacunación" . Cancer Immunol Immunother . 61 (11): 2003–11. doi : 10.1007 / s00262-012-1263-z . PMC 3493659 . PMID 22527252 .CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
- ^ "La Reserva Ecológica San Diego-La Jolla: Implicaciones para el Diseño y Manejo de Reservas Marinas" .
- ^ "Panel de actividades de investigación del Santuario Marino Nacional de las Islas del Canal y el Comité de Ciencias Marinas de las Islas del Canal, Borrador de las notas de la reunión" (PDF) .
- ^ "Historia de éxito de SBIR y STTR para Stellar Biotechnologies, Inc" .
- ^ "Fundación Nacional de Ciencias, información del adjudicatario" .