La recombinación específica de sitio , también conocida como recombinación específica de sitio conservadora , es un tipo de recombinación genética en la que tiene lugar el intercambio de cadenas de ADN entre segmentos que poseen al menos un cierto grado de homología de secuencia . [1] [2] [3] Enzimas conocidas como recombinasas específicas de sitio(SSR) realizan reordenamientos de los segmentos de ADN reconociendo y uniéndose a secuencias (sitios) de ADN cortos y específicos, en los que escinden la cadena principal del ADN, intercambian las dos hélices de ADN involucradas y vuelven a unir las cadenas de ADN. En algunos casos, la presencia de una enzima recombinasa y los sitios de recombinación es suficiente para que prosiga la reacción; en otros sistemas se requieren varias proteínas accesorias y / o sitios accesorios. Muchas estrategias de modificación del genoma diferentes , entre ellas el intercambio de casetes mediado por recombinasa (RMCE), un enfoque avanzado para la introducción dirigida de unidades de transcripción en loci genómicos predeterminados, se basan en SSR.
Los sistemas de recombinación de sitios específicos son altamente específicos, rápidos y eficientes, incluso cuando se enfrentan a genomas eucariotas complejos . [4] Se emplean de forma natural en una variedad de procesos celulares, incluida la replicación , diferenciación y patogénesis del genoma bacteriano , y el movimiento de elementos genéticos móviles . [5] Por las mismas razones, presentan una base potencial para el desarrollo de herramientas de ingeniería genética . [6]
Los sitios de recombinación tienen típicamente entre 30 y 200 nucleótidos de longitud y constan de dos motivos con una simetría de repetición invertida parcial, a la que se une la recombinasa, y que flanquean una secuencia de cruce central en la que tiene lugar la recombinación. Los pares de sitios entre los que se produce la recombinación suelen ser idénticos, pero hay excepciones (por ejemplo, attP y attB de λ integrasa ). [7]
Clasificación: recombinasas de tirosina frente a serina
Basándose en las homologías de secuencia de aminoácidos y la relación mecánica, la mayoría de las recombinasas específicas de sitio se agrupan en una de dos familias: la familia de recombinasas de tirosina (Tyr) o la familia de recombinasas de serina (Ser) . Los nombres provienen del residuo de aminoácido nucleofílico conservado presente en cada clase de recombinasa que se usa para atacar el ADN y que se une covalentemente a él durante el intercambio de hebras. Los primeros miembros identificados de la familia de la serina recombinasa se conocían como resolvasas o ADN invertasas , mientras que el miembro fundador de las tirosina recombinasas, la fago integrasa lambda (que usa sitios de reconocimiento attP / B), difiere de las ahora bien conocidas enzimas como Cre ( del fago P1 ) y FLP (de la levadura Saccharomyces cerevisiae ). Las recombinasas de serina famosas incluyen enzimas como la resolvasa gamma-delta (del transposón Tn 1000 ), la resolvasa Tn3 (del transposón Tn3) y la integrasa φ C31 (del fago φ C31). [8]
Aunque los miembros individuales de las dos familias de recombinasas pueden realizar reacciones con los mismos resultados prácticos, las familias no están relacionadas entre sí y tienen diferentes estructuras de proteínas y mecanismos de reacción. A diferencia de las tirosina recombinasas, las serina recombinasas son altamente modulares, como se insinuó por primera vez en estudios bioquímicos [9] y luego se mostró mediante estructuras cristalográficas. [10] [11] El conocimiento de estas estructuras proteicas podría resultar útil cuando se intenta rediseñar las proteínas recombinasas como herramientas para la manipulación genética.
Mecanismo
La recombinación entre dos sitios de ADN comienza por el reconocimiento y la unión de estos sitios (un sitio en cada una de dos moléculas de ADN bicatenarias separadas, o al menos dos segmentos distantes de la misma molécula) por la enzima recombinasa. A esto le sigue la sinapsis , es decir, unir los sitios para formar el complejo sináptico. Es dentro de este complejo sináptico donde tiene lugar el intercambio de hebras, ya que el ADN se escinde y se vuelve a unir mediante reacciones de transesterificación controladas . Durante el intercambio de hebras, cada molécula de ADN de doble hebra se corta en un punto fijo dentro de la región de cruce del sitio de reconocimiento, liberando un grupo hidroxilo desoxirribosa , mientras que la enzima recombinasa forma un enlace covalente transitorio a un fosfato de la cadena principal del ADN . Este enlace fosfodiéster entre el grupo hidroxilo de la serina nucleofílica o el residuo de tirosina conserva la energía que se gastó en la escisión del ADN. La energía almacenada en este enlace se utiliza posteriormente para volver a unir el ADN con el grupo hidroxilo de desoxirribosa correspondiente en la otra molécula de ADN. Por tanto, toda la reacción transcurre sin la necesidad de cofactores externos ricos en energía como el ATP .
Aunque la reacción química básica es la misma para las recombinasas de tirosina y serina, existen algunas diferencias entre ellas. [12] Las tirosina recombinasas, como Cre o FLP , escinden una hebra de ADN a la vez en puntos escalonados de 6 a 8 pb, uniendo el extremo 3 'de la hebra al grupo hidroxilo del nucleófilo tirosina (Fig. 1) . [13] El intercambio de hebras luego procede a través de una hebra cruzada intermedia análoga a la unión de Holliday en la que sólo se ha intercambiado un par de hebras. [14] [15]
El mecanismo y el control de las recombinasas de serina se comprenden mucho menos. Este grupo de enzimas solo se descubrió a mediados de la década de 1990 y todavía es relativamente pequeño. Los miembros ahora clásicos gamma-delta y resolvasa Tn3 , pero también nuevas adiciones como las integrasas φC31-, Bxb1- y R4, cortan las cuatro cadenas de ADN simultáneamente en puntos que están escalonados en 2 pb (Fig. 2). [16] Durante la escisión, se forma un enlace proteína-ADN mediante una reacción de transesterificación , en la que un enlace fosfodiéster se reemplaza por un enlace fosfoserina entre un fosfato 5 'en el sitio de escisión y el grupo hidroxilo del residuo de serina conservado (S10 en resolvasa). [17] [18]
Todavía no está del todo claro cómo se produce el intercambio de hebras después de que se ha escindido el ADN. Sin embargo, se ha demostrado que las hebras se intercambian mientras están unidas covalentemente a la proteína, con una rotación neta resultante de 180 °. [19] [20] El modelo más citado (pero no el único) que tiene en cuenta estos hechos es el "modelo de rotación de subunidades" (Fig. 2). [12] [21] Independientemente del modelo, los dúplex de ADN están situados fuera del complejo proteico y se necesita un gran movimiento de la proteína para lograr el intercambio de hebras. En este caso, los sitios de recombinación son ligeramente asimétricos, lo que permite que la enzima distinga los extremos izquierdo y derecho del sitio. Al generar productos, los extremos izquierdos siempre se unen a los extremos derechos de sus sitios asociados y viceversa. Esto hace que se reconstituyan diferentes sitios híbridos de recombinación en los productos de recombinación. La unión de los extremos izquierdos a la izquierda o de derecha a derecha se evita debido a la secuencia asimétrica de "superposición" entre los puntos escalonados de intercambio de hebra superior e inferior, que contrasta fuertemente con el mecanismo empleado por las tirosina recombinasas. [12]
La reacción catalizada por Cre-recombinasa, por ejemplo, puede conducir a la escisión del segmento de ADN flanqueado por los dos sitios (Figura 3A), pero también puede conducir a la integración o inversión de la orientación del segmento de ADN flanqueado (Figura 3B). ). El resultado de la reacción lo dictan principalmente las ubicaciones y orientaciones relativas de los sitios que se van a recombinar, pero también la especificidad innata del sistema específico del sitio en cuestión. Las escisiones e inversiones ocurren si la recombinación tiene lugar entre dos sitios que se encuentran en la misma molécula (recombinación intramolecular), y si los sitios están en el mismo (repetición directa) o en una orientación opuesta (repetición invertida), respectivamente. Las inserciones, por el contrario, tienen lugar si la recombinación se produce en sitios que están situados en dos moléculas de ADN diferentes (recombinación intermolecular), siempre que al menos una de estas moléculas sea circular. La mayoría de los sistemas de sitios específicos son altamente especializados, catalizan solo uno de estos diferentes tipos de reacción y han evolucionado para ignorar los sitios que están en la orientación "incorrecta".
Ver también
- Cre recombinasa
- Recombinación Cre-Lox
- Recombinación FLP-FRT
- Recombinación genética
- Recombinación homóloga
- Intercambio de casetes mediado por recombinasa
- Tecnología de recombinasa específica del sitio
Referencias
- ^ Bode, J; Schlake, T; asadasasada Iber, M; Schuebeler, D; Seibler, J; Snezhkov, E; Nikolaev, L (2000). "Caja de herramientas del transgenetista: métodos novedosos para la modificación dirigida de genomas eucariotas". Biol. Chem . 381 (9–10): 801–813. doi : 10.1515 / BC.2000.103 . PMID 11076013 . S2CID 36479502 .
- ^ Kolb, AF (2002). "Ingeniería del genoma utilizando recombinasas específicas del sitio". Clonación y células madre . 4 (1): 65–80. doi : 10.1089 / 153623002753632066 . PMID 12006158 .
- ^ Coates, CJ; Kaminski, JM; Summers, JB; Segal, DJ; Miller, AD; Kolb, AF (2005). "Modificación del genoma dirigida al sitio: derivados de enzimas modificadoras de BAL como herramientas de orientación" (PDF) . Tendencias en biotecnología . 23 (8): 407-19. doi : 10.1016 / j.tibtech.2005.06.009 . PMID 15993503 . Archivado desde el original (PDF) el 29 de agosto de 2006.
- ^ Sauer, B. (1998). "Orientación genética inducible en ratones mediante el sistema Cre / lox" (PDF) . Métodos . 14 (4): 381–92. doi : 10.1006 / meth.1998.0593 . PMID 9608509 . Archivado desde el original (PDF) el 11 de junio de 2011.
- ^ Nash, HA (1996). Recombinación específica del sitio: integración, escisión, resolución e inversión de segmentos de ADN definidos. Escherichia coli y Salmonella: biología celular y molecular , 2, págs. 2363-2376.
- ^ Akopian, A .; Stark, WM (2005). Recombinasas de ADN específicas de sitio como instrumentos para cirugía genómica . Avances en Genética. 55 . págs. 1–23. doi : 10.1016 / S0065-2660 (05) 55001-6 . ISBN 978-0-12-017655-7. PMID 16291210 .
- ^ Landy, A. (1989). "Aspectos dinámicos, estructurales y regulatorios de la recombinación específica del sitio lambda". Revisión anual de bioquímica . 58 (1): 913–41. doi : 10.1146 / annurev.bi.58.070189.004405 . PMID 2528323 .
- ^ Stark, WM; Boocock, MR (1995). "Selectividad topológica en recombinación específica de sitio". Elementos genéticos móviles . Prensa de la Universidad de Oxford. págs. 101-129.
- ^ Abdel-Meguid, SS; Grindley, ND; Templeton, NS; Steitz, TA (abril de 1984). "Escisión de la proteína de recombinación específica del sitio gamma delta resolvasa: el más pequeño de dos fragmentos se une al ADN específicamente" . Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 81 (7): 2001–5. Código bibliográfico : 1984PNAS ... 81.2001A . doi : 10.1073 / pnas.81.7.2001 . PMC 345424 . PMID 6326096 .
- ^ Yang, W .; Steitz, TA (1995). "Estructura cristalina de la recombinasa gamma delta resolvasa específica del sitio complejada con un sitio de escisión de 34 pb". Celular . 82 (2): 193–207. doi : 10.1016 / 0092-8674 (95) 90307-0 . PMID 7628011 . S2CID 15849525 .
- ^ Li, W .; Kamtekar, S; Xiong, Y; Sarkis, GJ; Grindley, ND; Steitz, TA (2005). "Estructura de un tetramero sináptico de gamma delta resolvasa enlazado covalentemente a dos ADN escindidos". Ciencia . 309 (5738): 1210–5. Código Bibliográfico : 2005Sci ... 309.1210L . doi : 10.1126 / science.1112064 . PMID 15994378 . S2CID 84409916 .
- ^ a b c Turan, S .; Bode, J. (2011). "Revisión: recombinasas específicas del sitio: de modificaciones genómicas basadas en etiquetas y diana a etiquetas e intercambio". FASEB J . 25 (12): 4088–4107. doi : 10.1096 / fj.11-186940 . PMID 21891781 .
- ^ Van Duyne, GD (2002). "Una vista estructural de la recombinación específica del sitio de la tirosina recombinasa". ADN móvil II . Prensa ASM. págs. 93-117.
- ^ Holliday, R. (1964). "Un mecanismo para la conversión de genes en hongos" (PDF) . Investigación genética . 5 (2): 282-304. doi : 10.1017 / S0016672300001233 .
- ^ Grainge, I .; Jayaram, M. (1999). "La familia integrasa de recombinasas: organización y función del sitio activo" . Microbiología molecular . 33 (3): 449–56. doi : 10.1046 / j.1365-2958.1999.01493.x . PMID 10577069 .
- ^ Stark, WM; Boocock, MR; Sherratt, DJ (1992). "Catálisis por recombinasas específicas de sitio". Tendencias en Genética . 8 (12): 432–9. doi : 10.1016 / 0168-9525 (92) 90327-Z . PMID 1337225 .
- ^ Reed, RR; Grindley, ND (1981). "Recombinación específica de sitio mediada por transposón in vitro: escisión de ADN y enlace proteína-ADN en el sitio de recombinación". Celular . 25 (3): 721–8. doi : 10.1016 / 0092-8674 (81) 90179-3 . PMID 6269756 . S2CID 28410571 .
- ^ Reed, RR; Moser, CD (1984). "Los intermedios de recombinación mediada por resolvasa contienen un residuo de serina unido covalentemente al ADN". Cold Spring Harb Symp Quant Biol . 49 : 245–9. doi : 10.1101 / sqb.1984.049.01.028 . PMID 6099239 .
- ^ Stark, MW; Sherratt, DJ; Boocock, MR (1989). "Recombinación específica del sitio por resolvasa Tn 3: cambios topológicos en las reacciones directa e inversa". Celular . 58 (4): 779–90. doi : 10.1016 / 0092-8674 (89) 90111-6 . PMID 2548736 . S2CID 46508016 .
- ^ Stark, WM; Boocock, MR (1994). "El cambio de vinculación de una reacción de anudado catalizada por Tn3 Resolvase". Revista de Biología Molecular . 239 (1): 25–36. doi : 10.1006 / jmbi.1994.1348 . PMID 8196046 .
- ^ Sarkis, GJ; Murley, LL; Leschziner, AE; Boocock, MR; Stark, WM; Grindley, ND (2001). "Un modelo para el complejo sináptico gamma-delta resolvasa". Célula molecular . 8 (3): 623–31. doi : 10.1016 / S1097-2765 (01) 00334-3 . PMID 11583624 .