ARN de horquilla corta

Tipo de ARN

Entrega lentiviral de shRNA y el mecanismo de interferencia del ARN en células de mamíferos.

Un ARN en horquilla corto o un ARN en horquilla pequeño ( shRNA / Hairpin Vector) es una molécula de ARN artificial con una curva cerrada que se puede usar para silenciar la expresión del gen diana a través de la interferencia de ARN (ARNi). ^{[1] [2] La} expresión de ARNhc en las células se logra típicamente mediante la administración de plásmidos o mediante vectores virales o bacterianos . El shRNA es un mediador ventajoso de RNAi porque tiene una tasa de degradación y recambio relativamente baja. Sin embargo, requiere el uso de un vector de expresión , que tiene el potencial de causar efectos secundarios en aplicaciones medicinales. ^[3]

La elección del promotor es esencial para lograr una expresión robusta de ARNhc. Al principio, se utilizaron promotores de la polimerasa III como U6 y H1; sin embargo, estos promotores carecen de control espacial y temporal. ^[3] Como tal, ha habido un cambio hacia el uso de promotores de la polimerasa II para regular la expresión del ARNhc.

Entrega

La expresión de ARNhc en células se puede obtener mediante la administración de plásmidos o mediante vectores virales o bacterianos .

El suministro de plásmidos a las células a través de la transfección para obtener la expresión de ARNhc se puede lograr usando reactivos in vitro disponibles comercialmente . Sin embargo, este método no es aplicable in vivo y, por tanto, tiene una utilidad limitada.

El uso de un vector bacteriano para obtener la expresión de ARNhc en células es un enfoque relativamente reciente. Se basa en investigaciones que muestran que la Escherichia coli recombinante , que contiene un plásmido con ARNhc, administrada a ratones puede eliminar la expresión del gen diana en el epitelio intestinal. ^[4] Este enfoque se utilizó en 2012 en ensayos clínicos para tratar a pacientes con poliposis adenomatosa familiar. ^[5]

Se puede usar una variedad de vectores virales para obtener la expresión de ARNhc en células, incluidos virus adenoasociados (AAV), adenovirus y lentivirus.. Con los virus adenoasociados y los adenovirus, los genomas permanecen episomales. Esto es ventajoso ya que se evita la mutagénesis por inserción. Es desventajoso porque la progenie de la célula perderá el virus rápidamente a través de la división celular, a menos que la célula se divida muy lentamente. Los AAV se diferencian de los adenovirus en que se han eliminado los genes virales y tienen una capacidad de empaquetamiento disminuida. Los lentivirus se integran en secciones de cromatina transcripcionalmente activa y, por lo tanto, se transmiten a las células progenitoras. Con este enfoque existe un mayor riesgo de mutagénesis por inserción; sin embargo, el riesgo se puede reducir mediante el uso de un lentivirus deficiente en integrasa. ^[6]

La proteína cortadora de Giardia intestinalis . ^[7]

Mecanismo de acción

Una vez que el vector se ha integrado en el genoma del hospedador, el ARNhc se transcribe en el núcleo mediante la polimerasa II o la polimerasa III, según la elección del promotor. El producto imita pri-microRNA (pri-miRNA) y es procesado por Drosha . El pre-shRNA resultante es exportado desde el núcleo por Exportin 5. Este producto es luego procesado por Dicer y cargado en el complejo silenciador inducido por RNA (RISC). La hebra sensorial (pasajera) se degrada. La hebra antisentido (guía) dirige RISC al ARNm que tiene una secuencia complementaria. En el caso de una complementariedad perfecta, RISC escinde el ARNm. En el caso de complementariedad imperfecta, RISC reprime la traducción del ARNm. En ambos casos, el shRNA conduce al silenciamiento del gen diana.

Aplicaciones en terapia génica

Debido a la capacidad del ARNhc para proporcionar silenciamiento génico específico y duradero, ha habido un gran interés en el uso de ARNhc para aplicaciones de terapia génica. A continuación se analizan tres ejemplos de terapias basadas en ARNhc.

Gradalis, Inc. desarrolló la vacuna FANG, que se usa en el tratamiento de cánceres avanzados. FANG se basa en un shRNA bifuncional (bi-shRNA) contra los factores de crecimiento transformantes inmunosupresores (TGF) β1 y β2. ^[8] Se recolectaron células tumorales autólogas de los pacientes y se introdujo ex vivo mediante electroporación un plásmido que codifica el ARNhc bifuncional y el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GMCSF) . Posteriormente, estas células se irradiaron y se inyectaron nuevamente en el paciente.

Marina Biotech desarrolló el CEQ508, que se utiliza para tratar la poliposis adenomatosa familiar. CEQ508 usa un vector bacteriano para administrar shRNA contra β-catenina.

Gradalis, Inc. desarrolló shRNA-STMN1 bifuncional (pbi-shRNA STMN1), que se usa para tratar cánceres avanzados y / o metastásicos. Este pbi-shRNA STMN1 es contra la estatmina 1 y se administra por vía intratumoral a través de la tecnología lipoplex (LP) de vesículas bilamelares invaginadas (BIV) .

Por lo general, los tratamientos basados ​​en shRNA enfrentan varios desafíos. El desafío más importante es la entrega. El ARNhc se administra típicamente mediante el uso de un vector y, aunque generalmente son eficientes, plantean importantes problemas de seguridad. En particular, los enfoques de terapia génica basados ​​en virus han demostrado ser peligrosos en ensayos clínicos anteriores. En la primera generación de terapia génica retroviral, algunos pacientes tratados con vectores virales para el síndrome de Wiskott-Aldrich desarrollaron leucemia aguda de células T. Se determinó que esto había sido causado por la ubicación de inserción del vector viral. ^[9] La sobresaturación potencial de RISC también es un problema. Si el ARNhc se expresa en niveles demasiado altos, es posible que la célula no pueda procesar correctamente el ARN endógeno, lo que podría causar problemas importantes. Otro desafío es la posibilidad de que el paciente pueda generar una respuesta inmune contra la terapia. ^[10] Finalmente, podría haber efectos fuera del objetivo y el ARNhc podría silenciar otros genes no deseados. Al desarrollar nuevas terapias exitosas basadas en ARNhc, se deben tener en cuenta todos estos desafíos.

Ver también

• Pequeño ARN interferente

Referencias

1. Paddison PJ, Caudy AA, Bernstein E, Hannon GJ, Conklin DS (abril de 2002). "Los ARN de horquilla corta (shRNA) inducen el silenciamiento específico de secuencia en células de mamíferos" . Genes y desarrollo . 16 (8): 948–58. doi : 10.1101 / gad.981002 . PMC  152352 . PMID  11959843 .
2. Brummelkamp TR, Bernards R , Agami R (abril de 2002). "Un sistema para la expresión estable de ARN interferentes cortos en células de mamíferos". Ciencia . 296 (5567): 550–3. doi : 10.1126 / science.1068999 . hdl : 1874/15573 . PMID 11910072 . 
3. Wang Z, Rao DD, Senzer N, Nemunaitis J (diciembre de 2011). "Interferencia de ARN y terapia contra el cáncer". Investigación farmacéutica . 28 (12): 2983–95. doi : 10.1007 / s11095-011-0604-5 . PMID 22009588 . 
4. Xiang S, Fruehauf J, Li CJ (junio de 2006). "Bacterias que expresan ARN de horquilla corta provocan interferencia de ARN en mamíferos". Biotecnología de la naturaleza . 24 (6): 697–702. doi : 10.1038 / nbt1211 . PMID 16699500 . 
5. Burnett JC, Rossi JJ, Tiemann K (septiembre de 2011). "Progreso actual de la terapéutica siRNA / shRNA en ensayos clínicos" . Revista de biotecnología . 6 (9): 1130–46. doi : 10.1002 / biot.201100054 . PMC 3388104 . PMID 21744502 .  
6. Lombardo A, Genovese P, Beausejour CM, Colleoni S, Lee YL, Kim KA, Ando D, Urnov FD, Galli C, Gregory PD, Holmes MC, Naldini L (noviembre de 2007). "Edición de genes en células madre humanas utilizando nucleasas de dedos de zinc y entrega de vectores lentivirales defectuosos en integrasa". Biotecnología de la naturaleza . 25 (11): 1298–306. doi : 10.1038 / nbt1353 . PMID 17965707 . 
7. Macrae IJ, Zhou K, Li F, Repic A, Brooks AN, Cande WZ, Adams PD, Doudna JA (enero de 2006). "Base estructural para el procesamiento de ARN bicatenario por Dicer". Ciencia . 311 (5758): 195–8. doi : 10.1126 / science.1121638 . PMID 16410517 . 
8. Senzer N, Barve M, Kuhn J, Melnyk A, Beitsch P, Lazar M, Lifshitz S, Magee M, Oh J, Mill SW, Bedell C, Higgs C, Kumar P, Yu Y, Norvell F, Phalon C, Taquet N, Rao DD, Wang Z, Jay CM, Pappen BO, Wallraven G, Brunicardi FC, Shanahan DM, Maples PB, Nemunaitis J (marzo de 2012). "Ensayo de fase I de la vacuna" bi-shRNAi (furina) / ADN de GMCSF / células tumorales autólogas "(FANG) en cáncer avanzado" . Terapia molecular . 20 (3): 679–86. doi : 10.1038 / mt.2011.269 . PMC 3293620 . PMID 22186789 .  
9. Personas DA, Baum C (febrero de 2011). "Resolver el problema de los vectores γ-retrovirales que contienen largas repeticiones terminales" . Terapia molecular . 19 (2): 229–31. doi : 10.1038 / mt.2010.305 . PMC 3034864 . PMID 21289636 .  
10. Whitehead KA, Dahlman JE, Langer RS, Anderson DG (2011). "¿Silenciamiento o estimulación? Entrega de ARNip y sistema inmunológico". Revista anual de ingeniería química y biomolecular . 2 : 77–96. doi : 10.1146 / annurev-chembioeng-061010-114133 . PMID 22432611 .