La inactivación viral consiste en evitar que los virus de una muestra determinada contaminen el producto deseado, ya sea eliminando los virus por completo o haciéndolos no infecciosos. Estas técnicas se utilizan ampliamente en las industrias alimentaria y del plasma sanguíneo [1] , ya que esos productos pueden resultar dañados por la presencia de partículas virales. Algunos de los virus más comunes que se eliminan con estos métodos son los virus VIH-1 y VIH-2 ; hepatitis A, B y C; y parvovirus . [2] Estos métodos se han adaptado para eliminar los priones , que no están relacionados con los virus, de los productos sanguíneos. [3]
Eliminación
Este proceso general, que se conoce simplemente como eliminación de virus, es uno en el que todos los virus de una muestra determinada se eliminan mediante métodos tradicionales de extracción o [energía completa]. Algunos de los métodos más destacados incluyen:
- Nanofiltración
- Cromatografia
Estos procesos de extracción se consideran "procesos tradicionales" porque no afectan químicamente al virus de ninguna manera; simplemente lo eliminan físicamente de la muestra.
Nanofiltración
Los procesos de eliminación de virus que utilizan técnicas de nanofiltración [4] eliminan los virus específicamente por exclusión de tamaño. Este tipo de proceso se usa típicamente para parvovirus [5] y otros virus que contienen una cubierta proteica . Un virión del VIH típico es de 180 nm y un parvovirus típico puede variar entre 15 y 24 nm, que es muy pequeño. Una gran ventaja de la filtración, a diferencia de los métodos que implican temperaturas o acidez extremas, es que la filtración no desnaturalizará las proteínas de la muestra. La nanofiltración también es eficaz para la mayoría de tipos de proteínas. Dado que no es químicamente selectivo, no importa cuál sea la química de la superficie de la partícula viral, los procesos de eliminación viral que utilizan técnicas de nanofiltración seguirán siendo eficaces. Otra gran ventaja de esta técnica es su capacidad para realizarse a escala de laboratorio y luego escalarse de manera efectiva a los estándares de producción. Sin embargo, es importante tener en cuenta el hecho de que el nivel de eliminación de los virus depende del tamaño de los poros del nanofiltro. En algunos casos, los virus muy pequeños no se filtrarán. También es necesario considerar los posibles efectos de la variación de presión y caudal.
Algunos de los filtros utilizados para realizar este tipo de procesos son Planova 15N, [6] Planova 20N, BioEX, VAG - 300, Viresolve 180, [7] Viresolve 70TM, y la gama Virosart [8] .
Cromatografia
Los métodos cromatográficos para eliminar virus son excelentes para purificar la proteína y también son efectivos contra todo tipo de virus, pero el nivel de eliminación del virus depende de la composición de la columna y los reactivos que se utilizan en el proceso. La eficacia de este proceso puede variar mucho entre virus y su eficacia puede cambiar según el búfer utilizado. El saneamiento entre lotes también es una preocupación al realizar este procedimiento.
La cromatografía de membrana es cada vez más popular para la purificación y eliminación de virus.
Inactivacion
La inactivación viral hace que los virus no puedan infectar. Muchos virus contienen capas de lípidos o proteínas que pueden inactivarse mediante alteraciones químicas. La inactivación viral es diferente de la eliminación viral porque, en el primer proceso, la química de la superficie del virus se altera y en muchos casos las partículas virales (ahora no infecciosas) permanecen en el producto final. En lugar de simplemente inactivar el virus, algunos procesos de inactivación viral en realidad desnaturalizan el virus por completo. La inactivación viral se utiliza ampliamente en la industria del plasma sanguíneo .
Para lograr la inactivación de los virus en la muestra, es necesario realizar procesos de purificación "especiales" que alterarán químicamente el virus de alguna manera. Algunos de los procesos más utilizados son los siguientes:
- Inactivación de disolventes / detergentes
- Pasteurización (calentamiento)
- Inactivación de pH ácido
En algunos casos, la inactivación viral no es una alternativa de eliminación viable porque incluso las partículas virales desnaturalizadas o inactivadas de otro modo pueden tener efectos perjudiciales en la corriente del proceso o en el producto mismo.
Inactivación de solvente / detergente (S / D)
Este proceso, desarrollado por el New York Blood Center , [9] es el método de inactivación viral más utilizado hasta la fecha. Se utiliza principalmente en la industria del plasma sanguíneo, por más de 50 organizaciones en todo el mundo y por la Cruz Roja Americana [1] . Sin embargo, este proceso solo es efectivo para virus envueltos en una capa lipídica . Los detergentes utilizados en este método interrumpen las interacciones entre las moléculas en la capa de lípidos del virus. La mayoría de los virus envueltos no pueden existir sin su recubrimiento lipídico, por lo que se destruyen cuando se exponen a estos detergentes. Es posible que otros virus no se destruyan, pero no pueden reproducirse, lo que los hace no infecciosos. El solvente crea un ambiente en el cual la reacción de agregación entre la capa lipídica y el detergente ocurre más rápidamente. El detergente que se usa típicamente es Triton X-100 .
Este proceso tiene muchas de las ventajas de las técnicas de eliminación "tradicionales". Este proceso no desnaturaliza las proteínas, porque los detergentes solo afectan a los lípidos y derivados de lípidos. Se logra una muerte viral del 100% mediante este proceso y el equipo es relativamente simple y fácil de usar. Sería necesario un equipo diseñado para purificar material inactivado post-virus para proteger contra la contaminación de las corrientes de proceso posteriores.
El tratamiento S / D utiliza reactivos fácilmente disponibles y relativamente económicos, pero estos reactivos deben eliminarse del producto antes de su distribución, lo que requeriría pasos de proceso adicionales. Debido a que este proceso elimina / inactiva la capa lipídica de un virus, los virus sin ningún tipo de envoltura lipídica no se verán afectados. Tampoco hay ningún efecto de inactivación por los tampones utilizados en este proceso.
Pasteurización
La inactivación de virus mediante pasteurización puede resultar muy eficaz si las proteínas que se intenta proteger son más térmicamente resistentes que las impurezas virales con las que se encuentran en solución. Algunas de las ventajas más destacadas de este tipo de procesos son que requieren un equipo sencillo y son eficaces tanto para virus envueltos como no envueltos. Debido a que la pasteurización implica aumentar la temperatura de la solución a un valor que desnaturalice suficientemente el virus, no importa si el virus tiene una envoltura o no, porque la envoltura por sí sola no puede proteger al virus de temperaturas tan altas. Sin embargo, se ha descubierto que algunas proteínas actúan como estabilizadores térmicos de virus. Por supuesto, si la proteína diana no es resistente al calor, el uso de esta técnica podría desnaturalizar esa proteína diana así como la impureza viral. Incubación típica tiene una duración de 10 horas y se realiza a 60 ° C .
Inactivación de pH ácido
Algunos virus, cuando se exponen a un pH bajo , se desnaturalizan espontáneamente. Similar a la pasteurización, esta técnica para la inactivación viral es útil si la proteína diana es más resistente a pH bajos que la impureza viral. Esta técnica es eficaz contra virus envueltos y el equipo que se utiliza normalmente es simple y fácil de operar. Sin embargo, este tipo de método de inactivación no es tan eficaz para virus sin envoltura y también requiere temperaturas elevadas. Entonces, para utilizar este método, la proteína objetivo debe ser resistente a pH bajos y altas temperaturas, lo que desafortunadamente no es el caso de muchas proteínas biológicas. La incubación para este proceso ocurre típicamente a un pH de 4 y dura entre 6 horas y 21 días.
Inactivación ultravioleta (UV)
Los rayos ultravioleta pueden dañar el ADN de los organismos vivos al crear dímeros de ácido nucleico. Sin embargo, los daños no suelen ser importantes debido a la baja penetración de los rayos ultravioleta a través de los tejidos vivos. Sin embargo, los rayos UV pueden usarse para inactivar virus, ya que las partículas de virus son pequeñas y los rayos UV pueden alcanzar el material genético, induciendo la dimerización de los ácidos nucleicos. Una vez que el ADN se dimeriza, las partículas de virus no pueden replicar su material genético, lo que evita que se propaguen.
Se ha demostrado que la luz ultravioleta en combinación con riboflavina es eficaz para reducir los patógenos en los productos de transfusión de sangre. [10] [11] La riboflavina y la luz ultravioleta dañan los ácidos nucleicos en virus, bacterias, parásitos y glóbulos blancos de los donantes, lo que los hace incapaces de replicarse y causar enfermedades. [12] [13] [14]
Estudios de picos
En muchos casos, la concentración de virus en una muestra determinada es extremadamente baja. En otros procesos de extracción, los niveles bajos de impurezas pueden ser insignificantes, pero debido a que los virus son impurezas infecciosas , incluso una partícula viral puede ser suficiente para arruinar toda la cadena del proceso. Es por esta razón que se deben tomar medidas especiales para determinar el método apropiado de eliminación o inactivación para cualquier tipo de virus que se extraiga de cualquier tipo de solución.
Los estudios de picos se crearon específicamente para este propósito. Un estudio de picos es un estudio realizado para determinar los posibles métodos de eliminación o inactivación viral. Los resultados de estos estudios son numéricos y, basándose en estos números, los investigadores pueden determinar si el proceso en el que se realizó el estudio será adecuado para los virus que están tratando de extraer y la solución de la que están tratando de extraerlos. .
El método
Se ha demostrado a través de la experimentación que aumentar el recuento viral (o el nivel de actividad) de una muestra en un factor de 10 4 o 10 5 del original solo cambiará las proporciones de eliminación / inactivación del virus en un orden de magnitud [¿referencia? ]. A partir de este conocimiento, se han creado estudios de picos en los que el número de virus (o el nivel de activación) aumenta o "aumenta" en un factor de 10 4 o 10 5 de la muestra original. Este nuevo alto número o nivel de actividad se pasa luego a través del flujo del proceso y se purifica. El número o nivel de actividad se toma al principio y al final del flujo del proceso y se usa en el cálculo del factor de reducción.
Factor de reducción
El factor de reducción (RF) para un paso de eliminación o inactivación de virus se calcula utilizando la siguiente ecuación: [15]
Paso de RF = log 10 [(V1 x T1) / (V2 x T2)]
Donde: V1 = volumen de materia prima enriquecida antes del paso de eliminación; T1 = concentración de virus de la materia prima enriquecida antes del paso de eliminación; V2 = volumen de material después del paso de limpieza; y T2 = concentración de virus del material después del paso de aclaramiento.
El factor de reducción necesario para una determinada corriente de proceso depende de muchos factores diferentes, algunos de los cuales incluyen:
- La concentración inicial esperada de virus.
- El producto que se está purificando
- La dosis infecciosa del virus (para uso in vivo )
- Si la inactivación es una alternativa viable para la eliminación completa.
- Las capacidades del laboratorio
- La relativa dificultad del método de inactivación o eliminación.
Aplicaciones
Esta tecnología se ha utilizado ampliamente en las industrias alimentaria y farmacéutica, pero algunas otras aplicaciones del procesamiento viral han sido:
Referencias
- ^ Shander A, Lobel GP, Javidroozi M (junio de 2016). "Prácticas transfusionales y riesgos infecciosos". Revisión de expertos en hematología . 9 (6): 597–605. doi : 10.1586 / 17474086.2016.1164593 . PMID 26959944 .
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