Oligonucleótido específico de alelo
Un oligonucleótido específico de alelo ( ASO ) es un fragmento corto de ADN sintético complementario a la secuencia de un ADN diana variable. Actúa como una sonda para la presencia de la diana en un ensayo de transferencia Southern o, más comúnmente, en el ensayo de transferencia de puntos más simple . Es una herramienta común que se utiliza en las pruebas genéticas , la investigación forense y la biología molecular .
Un ASO es típicamente un oligonucleótido de 15 a 21 bases de nucleótidos de longitud. Está diseñado (y utilizado) de una manera que lo hace específico para una sola versión, o alelo , del ADN que se está probando. [1] La longitud del ASO, de qué hebra se elige y las condiciones por las que se une (y se elimina) del ADN diana, juegan un papel importante en su especificidad. Estas sondas generalmente se pueden diseñar para detectar una diferencia de tan solo 1 base en la secuencia genética del objetivo, una capacidad básica en el ensayo de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), importante en el análisis del genotipo y el Proyecto Genoma Humano.. Para ser detectado después de que se ha unido a su objetivo, el ASO debe estar marcado con una etiqueta radiactiva, enzimática o fluorescente. La tecnología de ensayo de metilación de Illumina aprovecha el ASO para detectar la diferencia de un par de bases (citosina frente a timina) para medir la metilación en un sitio CpG específico.
La anemia de células falciformes es una enfermedad humana causada por una mutación genética en el codón del sexto aminoácido de la proteína sanguínea beta-hemoglobina . La secuencia de ADN normal GAG codifica el aminoácido glutamato , mientras que la mutación cambia la adenina media a timina , lo que conduce a la secuencia GTG (GUG en el ARNm ). Esta secuencia alterada sustituye una valina en la proteína final, distorsionando su estructura.
Para probar la presencia de la mutación en una muestra de ADN, se sintetizaría una sonda ASO para que fuera complementaria a la secuencia alterada, [2] aquí etiquetada como "S". Como control, se sintetizaría otro ASO para la secuencia normal "A". Cada ASO es completamente complementario a su secuencia objetivo (y se unirá fuertemente), pero tiene un único desajuste contra su alelo no objetivo (lo que conduce a una interacción más débil). El primer diagrama muestra cómo la sonda "S" es completamente complementaria al objetivo "S" (arriba), pero no coincide parcialmente con el objetivo "A" (abajo).
Un segmento de los genes de la beta-hemoglobina en los ADN de la muestra se amplificaría mediante PCR, y los productos resultantes se aplicarían a las membranas de soporte duplicadas como transferencias de puntos . Las hebras de ADN de la muestra se separan con álcali y cada sonda de ASO se aplica a una transferencia diferente. Después de la hibridación, se usa un protocolo de lavado que puede discriminar entre los híbridos totalmente complementarios y no emparejados. Los ASO no coincidentes se eliminan por lavado de las transferencias, mientras que los ASO coincidentes (y sus etiquetas) permanecen.
En el segundo diagrama, se han aplicado seis muestras de ADN amplificado a cada una de las dos transferencias. La detección de la etiqueta ASO que queda después del lavado permite una lectura directa del genotipo de las muestras, cada una con dos copias del gen de la beta-hemoglobina. Las muestras 1 y 4 solo tienen el alelo "A" normal, mientras que las muestras 3 y 5 tienen los alelos "A" y "S" (y por lo tanto son portadores heterocigotos de esta mutación recesiva ). Las muestras 2 y 6 tienen solo el alelo "S" y se verían afectadas por la enfermedad. La pequeña cantidad de "hibridación cruzada" que se muestra es típica y se considera en el proceso de interpretación de los resultados finales.
.jpg/440px-Allele-specific_oligonucleotide_(sample).jpg)
.jpg){kind=link}
