Ensayo de metilación de Illumina
El ensayo de metilación de Illumina que utiliza la plataforma Infinium I utiliza la tecnología 'BeadChip' [ aclaración necesaria ] para generar un perfil completo del genoma de la metilación del ADN humano . Similar a la secuenciación de bisulfito y pirosecuenciación , este método cuantifica los niveles de metilación en varios loci dentro del genoma . Este ensayo se utiliza para sondas de metilación en el BeadChip Illumina Infinium HumanMethylation27 (en adelante, matriz de [metilación] 27k). Sondas en las regiones diana de matriz de 27k del genoma humanopara medir los niveles de metilación en 27.578 dinucleótidos CpG en 14.495 genes. [1] La matriz Infinium HumanMethylation450 BeadChip se dirige a> 450.000 sitios de metilación. [2]
La metilación del ADN juega un papel importante en la regulación epigenética de la estructura de la cromatina , que en la última década ha sido reconocida como importante en la regulación de la expresión génica , el desarrollo y la impronta genética en vertebrados. [1] Se ha demostrado que los cambios en el patrón y el nivel de metilación contribuyen al cáncer y diversas enfermedades del desarrollo. [3] Por ejemplo, la hipermetilación en las islas CpG promotoras de un gen supresor de tumores , que a su vez conduce a su silenciamiento , se asocia con frecuencia con la tumorogénesis . [3]Una medición a gran escala de los patrones de metilación del ADN de una amplia selección de genes puede permitirnos comprender mejor las relaciones entre los cambios epigenéticos y la génesis de diferentes enfermedades y una mejor comprensión del papel que desempeña la epigenética en la diferenciación específica de tejidos .
El chip de metilación Illumina 27k contiene 27.578 sitios CpG individuales, distribuidos en 14.495 genes. [1] Estos genes incluyen genes RefSeq de la base de datos NCBI CCDS, genes de cáncer que muestran patrones de metilación diferenciales durante su curso de progresión y promotores de microARN. [4] Los marcadores incluidos en el chip se resumen en la Tabla 1. [4]
Para la tecnología química del ensayo Infinium I, el proceso se describe en la Figura 1.
Tratamiento
con bisulfito Se utiliza aproximadamente 1 μg de ADN genómico en la conversión de bisulfito para convertir la citosina no metilada en uracilo . El producto contiene citosina no convertida donde antes se metilaron, pero la citosina se convirtió en uracilo si no se metieron previamente.
Amplificación de ADN genómico completo
El ADN tratado con bisulfito se somete a amplificación de desplazamiento múltiple de genoma completo mediante cebado con hexámero aleatorio y ADN polimerasa Phi29 , que tiene una actividad de corrección de pruebas que da como resultado tasas de error 100 veces más bajas que la polimerasa Taq . A continuación, los productos se fragmentan enzimáticamente, [1] se purifican a partir de dNTP, cebadores y enzimas, y se aplican al chip. [5]
Hibridación y extensión de base única
En el chip, hay dos tipos de perlas para cada sitio CpG ( o "CG" , según la Figura 1) por locus. Cada locus probado se diferencia por diferentes tipos de perlas. [1] Ambos tipos de perlas se unen a oligonucleótidos de ADN de 50 mer de una sola hebra que difieren en secuencia solo en el extremo libre; este tipo de sonda se conoce como oligonucleótido específico de alelo. Uno de los tipos de perlas corresponderá al locus de citosina metilada y el otro corresponderá al locus de citosina no metilada, que se ha convertido en uracilo durante el tratamiento con bisulfito y luego amplificado como timina durante la amplificación del genoma completo. Los productos de ADN amplificado convertidos con bisulfito se desnaturalizan en hebras simples y se hibridan con el chip mediante hibridación específica de alelo con la sonda específica de metilación o la sonda de no metilación. A la hibridación le sigue la extensión de una sola base con didesoxinucleótidos marcados con hapteno . El ddCTP y el ddGTP están marcados con biotina, mientras que el ddATP y el ddUTP están marcados con 2,4-dinitrofenol (DNP). [6]
