Un gráfico de chevron es una forma de representar los datos cinéticos de plegamiento de proteínas en presencia de concentraciones variables de desnaturalizante que altera la estructura terciaria nativa de la proteína . La gráfica se conoce como gráfica de "chevron" debido a la forma canónica v , o chevron observada cuando el logaritmo de la tasa de relajación observada se representa como una función de la concentración de desnaturalizante.
En un sistema de dos estados, las tasas de plegado y desplegado dominan las tasas de relajación observadas por debajo y por encima del punto medio de desnaturalización (Cm). Esto da lugar a la terminología de brazos plegables y desplegados para las extremidades del galón. Se puede obtener información a priori sobre la Cm de una proteína a partir de experimentos de equilibrio. Al ajustarse a un modelo de dos estados, se supone que el logaritmo de las tasas de plegado y desplegado depende linealmente de la concentración de desnaturalizante, lo que da como resultado las pendientes m f y m u, denominados valores m de plegado y desplegado, respectivamente (también denominados valores m cinéticos). La suma de las dos tasas es la tasa de relajación observada. Un acuerdo entre el valor m de equilibrio y la suma absoluta de los valores m cinéticos se ve típicamente como una firma para el comportamiento de dos estados. La mayoría de los experimentos de desnaturalización informados se han llevado a cabo a 298 K con urea o cloruro de guanidinio (GuHCl) como desnaturalizantes.
Metodología experimental
Para generar la rama plegable del galón, la proteína en una solución desnaturalizante altamente concentrada se diluye rápidamente (en menos de un milisegundo) en un tampón apropiado hasta una concentración de desnaturalizante particular por medio de un aparato de flujo detenido . La relajación al nuevo equilibrio se controla mediante sondas espectroscópicas como la fluorescencia o, con menor frecuencia, mediante dicroísmo circular (CD). El volumen de la dilución se ajusta para obtener la tasa de relajación a una concentración de desnaturalizante específica. La concentración final de proteína en la mezcla suele ser de 1 a 20 µM, dependiendo de las limitaciones impuestas por la amplitud de la relajación y la relación señal-ruido. La rama que se despliega se genera de una manera similar mezclando proteína sin desnaturalizante con una solución desnaturalizante concentrada en tampón. Cuando se grafica el logaritmo de estas tasas de relajación en función de la concentración final de desnaturalizante, se obtiene un gráfico de chevron.
La mezcla de las soluciones determina el tiempo muerto del instrumento, que es de aproximadamente un milisegundo. Por lo tanto, un aparato de flujo detenido solo se puede emplear para proteínas con un tiempo de relajación de unos pocos milisegundos. En los casos en los que el tiempo de relajación es más corto que el tiempo muerto del instrumento, la temperatura experimental se reduce (aumentando así la viscosidad del agua / tampón) para aumentar el tiempo de relajación a unos pocos milisegundos. Por otro lado, para proteínas de plegado rápido (es decir, aquellas con una tasa de relajación de 1 a 100 microsegundos), salto de presión (tiempo muerto ~ pocos microsegundos), [1] salto de temperatura ( salto T; tiempo muerto ~ pocos nanosegundos ) o mezcla de flujo continuo (tiempo muerto ~ pocos microsegundos), [2] se puede llevar a cabo a diferentes concentraciones de desnaturalizante para obtener un gráfico de chevron.
Rollos de Chevron
Aunque se supone que las ramas del galón son lineales con la concentración de desnaturalizante, no siempre es así. Las no linealidades generalmente se observan en ambas extremidades o en una de ellas y se denominan vueltas de chevron. La razón de tal observación no está clara. Muchas interpretaciones incluyen intermedios en la vía, [3] limitaciones de tiempo muerto, movimientos de estado de transición ( efecto Hammond ), [4] artefactos de agregación, [5] plegamiento cuesta abajo , [6] y efectos Debye-Hückel inducidos por la sal [7] se han propuesto para explicar este comportamiento. En muchos casos, los vuelcos de las extremidades plegables se ignoran, ya que ocurren a bajas concentraciones de desnaturalizante, y los datos se ajustan a un modelo de dos estados con una dependencia lineal de las tasas. Las tasas de plegamiento informadas para tales proteínas en ausencia de desnaturalizantes son por tanto una sobreestimación.
Ver también
Referencias
- ^ Jenkins DC, Pearson DS, Harvey A, Identificación de Sylvester, Geeves MA, Pinheiro T (2009). "Plegado rápido de la proteína priónica capturada por salto de presión" . Eur Biophys J . 38 (5): 625–35. doi : 10.1007 / s00249-009-0420-6 . PMC 4509520 . PMID 19255752 .
- ^ Ferguson N, Johnson CM, Macias M, Oschkinat H, Fersht A (2001). "Plegado ultrarrápido de dominios WW sin racimos aromáticos estructurados en el estado desnaturalizado" . Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 98 (23): 13002-13007. Código Bibliográfico : 2001PNAS ... 9813002F . doi : 10.1073 / pnas.221467198 . PMC 60814 . PMID 11687613 .
- ^ Sánchez IE, Kiefhaber T (2003). "Evidencia de barreras secuenciales e intermedios obligatorios en aparente plegamiento de proteínas de dos estados". J. Mol. Biol . 325 (2): 367–376. doi : 10.1016 / S0022-2836 (02) 01230-5 . PMID 12488101 .
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- ^ Fui, HM; Benítez-Cardoza, CG; Jackson, SE (2004). "¿Hay un estado intermedio poblado en la vía de plegamiento de la ubiquitina?" . Cartas FEBS . 567 (2–3): 333–8. doi : 10.1016 / j.febslet.2004.04.089 . PMID 15178347 .
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- ^ Ríos M, Plaxco K (2005). "Efectos aparentes de Debye-Huckel en el plegamiento de una proteína de dominio único simple". Bioquímica . 44 (4): 1243-1250. doi : 10.1021 / bi048444l . PMID 15667218 .