En bioquímica , el despliegue de equilibrio es el proceso de desplegar una proteína o molécula de ARN cambiando gradualmente su entorno, como cambiando la temperatura o la presión , el pH , agregando desnaturalizantes químicos o aplicando fuerza como con la punta de un microscopio de fuerza atómica . [1] [2] Si el equilibrio se mantuvo en todos los pasos, el proceso teóricamente debería ser reversible durante el plegamiento del equilibrio . El despliegue de equilibrio se puede utilizar para determinar la estabilidad termodinámica de la estructura de la proteína o del ARN, es decir, la diferencia de energía libre entre el plieguey estados desplegados .
Antecedentes teóricos
En su forma más simple, el desarrollo del equilibrio supone que la molécula puede pertenecer a sólo dos estados termodinámicos, el estado plegado (normalmente denominado N para el estado "nativo") y el estado desplegado (normalmente denominado U ). Este modelo de plegamiento de proteínas de "todo o nada" fue propuesto por primera vez por Tim Anson en 1945, [3] pero se cree que sólo se aplica a dominios estructurales pequeños y únicos de proteínas (Jackson, 1998); Los dominios más grandes y las proteínas de múltiples dominios a menudo exhiben estados intermedios. Como es habitual en la mecánica estadística , estos estados corresponden a conjuntos de conformaciones moleculares, no solo a una conformación.
La molécula puede hacer la transición entre los estados nativo y desplegado de acuerdo con un modelo cinético simple.
- N ⇌ U
con constantes de velocidad y para el plegado) y desplegándose () reacciones, respectivamente. La constante de equilibrio adimensional se puede utilizar para determinar la estabilidad conformacional por la ecuación
dónde es la constante del gas yes la temperatura absoluta en kelvin . Por lo tanto, es positivo si el estado desplegado es menos estable (es decir, desfavorecido) en relación con el estado nativo.
La forma más directa de medir la estabilidad conformacional. de una molécula con plegamiento de dos estados es medir sus constantes de velocidad cinética y bajo las condiciones de solución de interés. Sin embargo, dado que el plegamiento de proteínas se completa típicamente en milisegundos, tales mediciones pueden ser difíciles de realizar, por lo general requieren un costoso flujo detenido o (más recientemente) mezcladores de flujo continuo para provocar el plegado con una resolución de tiempo alta. La interferometría de polarización dual es una técnica emergente para medir directamente el cambio conformacional y.
Desnaturalización química
En la técnica menos extensa de desarrollo del equilibrio , las fracciones de moléculas plegadas y desplegadas (denotadas como y , respectivamente) se miden a medida que las condiciones de la solución cambian gradualmente de las que favorecen el estado nativo a las que favorecen el estado desplegado, por ejemplo, mediante la adición de un desnaturalizante tal como clorhidrato de guanidinio o urea . (En el plegamiento de equilibrio , se lleva a cabo el proceso inverso). Dado que las fracciones deben sumar uno y su relación debe estar dada por el factor de Boltzmann , tenemos
Las estabilidades de las proteínas suelen variar linealmente con la concentración de desnaturalizante. Se han propuesto varios modelos para explicar esta observación, entre los que destacan el modelo de unión desnaturalizante , el modelo de intercambio de disolvente (ambos de John Schellman [4] ) y el modelo de extrapolación lineal (LEM; de Nick Pace [5] ). Todos los modelos asumen que solo dos estados termodinámicos están poblados / despoblados después de la desnaturalización. Podrían ampliarse para interpretar esquemas de reacción más complicados.
El modelo de unión desnaturalizante asume que hay sitios específicos pero independientes en la molécula de proteína (plegada o desplegada) a los que se une el desnaturalizante con una constante de unión k efectiva (promedio) . El equilibrio se desplaza hacia el estado desplegado a altas concentraciones de desnaturalizante, ya que tiene más sitios de unión para el desnaturalizante en relación con el estado plegado (). En otras palabras, el mayor número de sitios potenciales expuestos en el estado desplegado se considera la razón de las transiciones de desnaturalización. Un tratamiento elemental da como resultado la siguiente forma funcional:
dónde es la estabilidad de la proteína en agua y [D] es la concentración de desnaturalizante. Por tanto, el análisis de los datos de desnaturalización con este modelo requiere 7 parámetros:,, k , y las pendientes e intersecciones de las líneas base de estado plegadas y desplegadas.
El modelo de intercambio de solventes (también llamado "modelo de unión débil" o "solvatación selectiva") de Schellman invoca la idea de un equilibrio entre las moléculas de agua unidas a sitios independientes en la proteína y las moléculas desnaturalizantes en solución. Tiene la forma:
dónde es la constante de equilibrio para la reacción de intercambio y es la fracción molar del desnaturalizante en solución. Este modelo intenta responder a la pregunta de si las moléculas desnaturalizantes realmente se unen a la proteína o parecen estar unidas solo porque los desnaturalizantes ocupan alrededor del 20-30% del volumen total de la solución a altas concentraciones utilizadas en experimentos, es decir, efectos no específicos. y de ahí el término "unión débil". Al igual que en el modelo de unión a desnaturalizante, el ajuste a este modelo también requiere 7 parámetros. Un tema común obtenido de estos dos modelos es que las constantes de unión (en la escala molar) para la urea y el clorhidrato de guanidinio son pequeñas: ~ 0,2 para urea y 0.6 para GuHCl.
Intuitivamente, la diferencia en el número de sitios de unión entre los estados plegado y desplegado es directamente proporcional a las diferencias en el área de superficie accesible. Esto forma la base del LEM que asume una dependencia lineal simple de la estabilidad de la concentración de desnaturalizante. La pendiente resultante del gráfico de estabilidad frente a la concentración de desnaturalizante se denomina valor m. En términos matemáticos puros, el valor m es la derivada del cambio en la energía libre de estabilización tras la adición de desnaturalizante. Sin embargo, Pace y sus colaboradores han documentado una fuerte correlación entre el área de superficie accesible (ASA) expuesta al desplegarse, es decir, la diferencia en el ASA entre el estado desplegado y plegado de la proteína estudiada (dASA), y el valor m. . [5] En vista de esta observación, los valores m se interpretan típicamente como proporcionales al dASA. No existe una base física para el LEM y es puramente empírico, aunque se usa ampliamente para interpretar datos de desnaturalización de solventes. Tiene la forma general:
donde la pendiente se llama " valor m " (> 0 para la definición anterior) y(también llamado C m ) representa la concentración de desnaturalizante a la que se pliegan el 50% de las moléculas (el punto medio de desnaturalización de la transición, donde).
En la práctica, los datos experimentales observados a diferentes concentraciones de desnaturalizante se ajustan a un modelo de dos estados con esta forma funcional para , junto con líneas de base lineales para los estados plegado y desplegado. La y son dos parámetros de ajuste, junto con otros cuatro para las líneas base lineales (pendiente e intersección para cada línea); en algunos casos, se supone que las pendientes son cero, lo que da cuatro parámetros de ajuste en total. La estabilidad conformacional se puede calcular para cualquier concentración de desnaturalizante (incluida la estabilidad en desnaturalizante cero) a partir de los parámetros ajustados y . Cuando se combina con datos cinéticos sobre el plegado, el valor m se puede utilizar para estimar aproximadamente la cantidad de superficie hidrófoba enterrada en el estado de transición de plegado.
Sondas estructurales
Desafortunadamente, las probabilidades y no se puede medir directamente. En su lugar, analizamos la población relativa de moléculas plegadas utilizando varias sondas estructurales, por ejemplo, absorbancia a 287 nm (que informa sobre la exposición al disolvente de triptófano y tirosina ), dicroísmo circular ultravioleta lejano (180-250 nm, que informa sobre la estructura de la estructura de la proteína), interferometría de polarización dual (que informa el tamaño molecular y la densidad de pliegues) y fluorescencia casi ultravioleta (que informa sobre los cambios en el entorno del triptófano y la tirosina). Sin embargo, casi cualquier sonda de estructura plegada funcionará; dado que la medición se toma en equilibrio, no hay necesidad de una resolución de tiempo alta. Por tanto, se pueden realizar mediciones de los desplazamientos químicos de RMN , la viscosidad intrínseca , la exposición al disolvente (reactividad química) de las cadenas laterales como la cisteína, la exposición del esqueleto a las proteasas y diversas mediciones hidrodinámicas.
Para convertir estas observaciones en probabilidades y , generalmente se asume que el observable adopta uno de dos valores, o , correspondientes al estado nativo o desplegado, respectivamente. Por tanto, el valor observado es igual a la suma lineal
Al ajustar las observaciones de bajo varias condiciones de solución a esta forma funcional, se puede estimar y , así como los parámetros de . Las variables de ajuste y a veces se permite que varíen linealmente con las condiciones de la solución, por ejemplo, la temperatura o la concentración de desnaturalizante, cuando las asíntotas de se observa que varían linealmente en condiciones de fuerte plegado o muy desplegado.
Desnaturalización térmica
Suponiendo una desnaturalización de dos estados como se indicó anteriormente, se pueden derivar los parámetros termodinámicos fundamentales, a saber, , y siempre que uno tenga conocimiento sobre el del sistema bajo investigación.
Los observables termodinámicos de desnaturalización se pueden describir mediante las siguientes ecuaciones:
dónde , y indican la entalpía , la entropía y la energía libre de Gibbs de desplegarse bajo un pH y presión constantes. La temperatura,se varía para probar la estabilidad térmica del sistema yes la temperatura a la que se despliegan la mitad de las moléculas del sistema. La última ecuación se conoce como ecuación de Gibbs-Helmholtz .
Determinación de la capacidad calorífica de las proteínas.
En principio, se pueden calcular todos los observables termodinámicos anteriores a partir de un único termograma de calorimetría diferencial de barrido del sistema suponiendo que eles independiente de la temperatura. Sin embargo, es difcil obtener valores precisos paraPor aquí. Más exactamente, el puede derivarse de las variaciones en vs. que se puede lograr a partir de mediciones con ligeras variaciones en el pH o la concentración de proteínas . La pendiente del ajuste lineal es igual a la. Tenga en cuenta que cualquier no linealidad de los puntos de datos indica queprobablemente no sea independiente de la temperatura.
Alternativamente, el también se puede estimar a partir del cálculo del área de superficie accesible (ASA) de una proteína antes y después de la desnaturalización térmica de la siguiente manera:
Para las proteínas que tienen una estructura tridimensional conocida, la se puede calcular a través de programas de computadora como Deepview (también conocido como swiss PDB viewer ). La se puede calcular a partir de valores tabulados de cada aminoácido mediante la ecuación semi-empírica:
donde los subíndices polar, no polar y aromático indican las partes de los 20 aminoácidos naturales.
Finalmente, para las proteínas existe una correlación lineal entre y mediante la siguiente ecuación: [6]
Evaluación del desarrollo de dos estados
Además, se puede evaluar si el plegado procede de acuerdo con un desplegado de dos estados como se describió anteriormente. Esto se puede hacer con calorimetría de barrido diferencial comparando la entalpía calorimétrica de desnaturalización, es decir, el área debajo del pico, a la entalpía de van 't Hoff descrita de la siguiente manera:
a la se puede describir como:
Cuando se observa un desarrollo de dos estados, . La es la altura del pico de capacidad calorífica.
Generalización a complejos proteicos y proteínas multidominio.
Usando los principios anteriores, se han derivado ecuaciones que relacionan una señal de proteína global, correspondiente a los estados de plegamiento en equilibrio, y el valor variable de un agente desnaturalizante, ya sea temperatura o una molécula química, para proteínas homoméricas y heteroméricas, desde monómeros hasta trímeros. y potencialmente tetrámeros. Estas ecuaciones proporcionan una base teórica sólida para medir la estabilidad de proteínas complejas y para comparar las estabilidades de proteínas mutantes y de tipo salvaje. [7] Tales ecuaciones no se pueden derivar para pentámeros de oligómeros superiores debido a limitaciones matemáticas (teorema de Abel-Ruffini).
Referencias
- ^ Lassalle, Michael W .; Akasaka, Kazuyuki (2007). "El uso de resonancia magnética nuclear de alta presión para estudiar el plegamiento de proteínas". En Bai, Yawen; Nussinov, Ruth (eds.). Protocolos de plegamiento de proteínas . Totowa, Nueva Jersey: Humana Press. págs. 21–38 . ISBN 1-59745-189-4.
- ^ Ng, Sean P .; Randles, Lucy G; Clarke, Jane (2007). "El uso de resonancia magnética nuclear de alta presión para estudiar el plegamiento de proteínas". En Bai, Yawen; Nussinov, Ruth (eds.). Protocolos de plegamiento de proteínas . Totowa, Nueva Jersey: Humana Press. págs. 139-167 . ISBN 1-59745-189-4.
- ^ Anson ML, Desnaturalización de proteínas y las propiedades de los grupos de proteínas, Avances en la química de las proteínas, 2, 361-386 (1945)
- ^ Schellmann, JA, La termodinámica del intercambio de solventes, Biopolymers 34, 1015-1026 (1994)
- ^ a b Myers JK, Pace CN, Scholtz JM, Valores de desnaturalización my cambios en la capacidad calorífica: relación con los cambios en las áreas de superficie accesibles del despliegue de proteínas, Protein Sci. 4 (10), 2138–2148 (1995)
- ^ Robertson, AD, Murphy, KP Estructura de la proteína y la energía de la estabilidad de la proteína, (1997), Chem Rev , 97 , 1251-1267
- ^ Bedouelle, Hugues (2016). "Principios y ecuaciones para medir e interpretar la estabilidad de las proteínas: de monómero a tetrámero". Biochimie . 121 : 29–37. doi : 10.1016 / j.biochi.2015.11.013 . PMID 26607240 .
Otras lecturas
- Pace CN. (1975) "La estabilidad de las proteínas globulares", CRC Critical Reviews in Biochemistry , 1-43.
- Santoro MM y Bolen DW. (1988) "Despliegue de cambios de energía libre determinados por el método de extrapolación lineal. 1. Despliegue de fenilmetanosulfonil α-quimotripsina usando diferentes desnaturalizantes", Biochemistry , 27 , 8063-8068.
- Privalov PL. (1992) "Base física para la estabilidad de las conformaciones plegadas de las proteínas", en Protein Folding , TE Creighton, ed., WH Freeman, págs. 83-126.
- Yao M y Bolen DW. (1995) "¿Cuán válidas son las mediciones de energía libre desplegadas inducidas por desnaturalizantes? Nivel de conformidad con los supuestos comunes sobre un rango extendido de estabilidad de la ribonucleasa A", Bioquímica , 34 , 3771-3781.
- Jackson SE. (1998) "¿Cómo se pliegan las proteínas pequeñas de un solo dominio?", Folding & Design , 3 , R81-R91.
- Schwehm JM y Stites WE. (1998) "Aplicación de métodos automatizados para la determinación de la estabilidad conformacional de proteínas", Methods in Enzymology , 295 , 150-170.