El punto de control de daño del ADN G 2- M es un punto de control importante del ciclo celular en los organismos eucariotas que asegura que las células no inicien la mitosis hasta que el ADN dañado o replicado de forma incompleta esté suficientemente reparado. Las células que tienen un punto de control G 2 -M defectuoso , si entran en la fase M antes de reparar su ADN, conduce a la apoptosis o muerte después de la división celular. [1] La característica bioquímica definitoria de este punto de control es la activación de complejos de ciclina-CDK en fase M , que fosforilan proteínas que promueven el ensamblaje del huso y llevan a la célula a la metafase.. [2]
Actividad de ciclina B-CDK 1
El ciclo celular es impulsado por proteínas llamadas quinasas dependientes de ciclina que se asocian con proteínas reguladoras de ciclina en diferentes puntos de control del ciclo celular. Las diferentes fases del ciclo celular experimentan activación y / o desactivación de complejos específicos de ciclina-CDK.
La actividad de CyclinB-CDK1 es específica del punto de control G2 / M. La acumulación de ciclina B aumenta la actividad del homólogo humano Cdc2 de la quinasa dependiente de ciclina Cdk1 a medida que las células se preparan para entrar en la mitosis. La actividad de Cdc2 se regula además mediante la fosforilación / desfosforilación de sus correspondientes activadores e inhibidores. A través de un circuito de retroalimentación positiva , CyclinB-Cdc2 activa la fosfatasa Cdc25 que a su vez desactiva los inhibidores de CyclinB-Cdc2, Wee1 y Myt1. Cdc25 activa el complejo mediante la eliminación de fosfatos del sitio activo, mientras que Wee1 inactiva el complejo mediante la fosforilación de residuos de tirosina, específicamente tirosina-15. [3]
Este bucle se amplifica aún más indirectamente a través de la interacción coordinada de la quinasa Aurora A y el cofactor Bora. Durante la fase G2 , Bora se acumula y forma un complejo de activación con Aurora A. Este complejo luego regula la activación de la quinasa tipo Polo 1 (Plk1). Plk1 fosforila Wee1, dirigiéndolo a la degradación a través del complejo de ligasa de ubiquitina SCF ( complejo SCF ) y activa Cdc25 a través de la fosforilación con acción combinada que activa Cdc2. La actividad combinada y el complejo de Cdc2, Cdc25 y Plk1 con la acumulación de ciclina B activa el complejo CyclinB-Cdc2, promoviendo la entrada en la mitosis. [4]
Muchas proteínas involucradas en este circuito de retroalimentación positiva impulsan la activación del complejo CyclinB-Cdc2 porque la entrada en la mitosis requiere una respuesta de todo o nada. El modelo de Novak-Tyson es un modelo matemático utilizado para explicar tal bucle regulador que predijo la transición irreversible a la mitosis impulsada por histéresis. [5] Mediante experimentos en extractos de óvulos libres de células de Xenopus laevis , se confirmó que dicho modelo era la base para la entrada en la mitosis. Una vez que la concentración de ciclina alcanza un cierto umbral mínimo de activación, Cdc2 se activa rápidamente. Permanece en este estado hasta que la actividad cae por debajo de un umbral de inactivación separado en el que se inactiva abruptamente mediante la fosforilación de tirosina por Wee1 y Myt1. En el caso de ADN no replicado, el umbral de concentración de ciclina para la activación de Cdc2 aumenta aún más. A través de este mecanismo, existen dos condiciones de estado estacionario separadas separadas por un estado estacionario inestable. La naturaleza biestable e histerética de CyclinB-Cdc2 asegura una naturaleza altamente regulada del punto de control G2 / M. [6]
Respuesta de la vía al daño del ADN
Las proteínas que se localizan en los sitios de daño del ADN en la fase G2 inician una cascada de señalización que regula componentes importantes de la vía, como se describió anteriormente, controlando así la entrada mitótica a través de la actividad de CyclinB-Cdc2. La regulación negativa de la actividad de CyclinB-Cdc2 da como resultado un retraso en la entrada mitótica, que es importante para que las células repare cualquier daño del ADN que pueda haberse acumulado después de la fase S y sea necesario antes de que pueda continuar la división celular.
Las proteínas que funcionan en el punto de control G2-M se identificaron originalmente en pantallas de levadura que buscaban mutantes que mostraran una mayor sensibilidad a la radiación, denominados mutantes "rad". [1] La reparación ineficaz del ADN dañado por radiación ionizante o agentes químicos en estos mutantes reveló proteínas esenciales en esta vía. Las proteínas de señalización temprana en la vía del punto de control son miembros de una familia de fosfatidilinositol 3-quinasas, rad3 en levaduras y ATR en vertebrados, que se cree que se localizan en sitios de daño del ADN. [7] Rad3 fosforila rad26 que se requiere para iniciar, pero no mantener el punto de control. Rad3 también fosforila una serie de otras proteínas cuya ausencia anula la reparación del ADN del punto de control, incluidas rad1, rad9, hus1 y rad17. [1] Se ha planteado la hipótesis de que rad9, hus1 y rad17 son similares a las proteínas involucradas en la formación de la abrazadera que aumenta la procesividad de la ADN polimerasa durante la replicación del ADN . [8] De acuerdo con esta idea, rad17 es similar a las proteínas involucradas en la carga de la abrazadera en el ADN. Esto respalda un modelo en el que la fosforilación por rad3 provoca el reclutamiento de estas proteínas en sitios de daño del ADN donde median la actividad de las ADN polimerasas involucradas en la reparación del ADN . [1]
El efector principal de rad3 es la quinasa Chk1 , que se requiere para la detención de G2-M en respuesta a agentes que dañan el ADN. [9] Chk1 es una proteína quinasa efectora que mantiene la ciclina mitótica en un estado inactivo y es fosforilada por rad3 entre la fase S y la mitosis, lo que implica su papel específico en la detención de G2. [10] Su regulación positiva a través de la sobreexpresión puede inducir el arresto independientemente del daño del ADN. [11] Además, la sobreexpresión de Chk1 rescata la sensibilidad a la radiación de los mutantes rad, presumiblemente al permitir que se produzca la reparación del ADN antes de la entrada en la mitosis. [7]
La presencia de daño en el ADN desencadena las vías ATM (ataxia telangiectasia mutada) o ATR (ataxia telangiectasia y relacionada con Rad3) que activan las quinasas Chk2 y Chk1, respectivamente. Estas quinasas actúan corriente arriba de Cdc25 y Wee1, los reguladores directos del complejo CyclinB-Cdc2. Chk1 y Chk2 fosforilan Cdc25, inhibiendo su actividad fosforilante y marcándolo para degradación ubiquitinada. [11] [12] Estas vías también estimulan el supresor de tumores p53 . p53 regula la función del inhibidor de Cdk2 p21 y las proteínas 14-3-3 que fosforilan (y por lo tanto inactivan) y secuestran Cdc25 en el citoplasma, respectivamente. [13] Estudios recientes también han sugerido que Cdk1 y 14-3-3 regulan positivamente Wee1 de manera similar. La hiperfosforilación de Wee1 por Cdk1 permite la unión de 14-3-3, secuestrando Wee1 al núcleo y mejorando su capacidad para fosforilar Cdc2. [14] La fosforilación de Wee1 y Cdc25 previene la activación de Cdc2. [12]
La vía ATM / ATR también da como resultado la regulación negativa de Plk1 que contribuye a la estabilidad de Wee1. La estabilización de Wee1 y Myt1 asegura que las células se detengan en G2 y permite la reparación del ADN. [13] [15]
Múltiples vías están involucradas en la respuesta del punto de control y, por lo tanto, la focalización de Cdc25 no es el único mecanismo subyacente al retraso del ciclo celular, como han propuesto algunos modelos. La cooperación entre la regulación positiva de Wee1 y la regulación negativa de Cdc25 por Chk1 en respuesta a un ADN no replicado o dañado da como resultado una fuerte detención de G2. [1] [11] [13] [15] El aumento en la cantidad de Wee1 y la disminución en la cantidad de Cdc25 contribuyen al aumento en el umbral de concentración de ciclina B en el circuito de histéresis necesario para conducir la célula a la mitosis.
Manteniendo el puesto de control
Se requiere Rad3 para la activación de Chk1 y el inicio de la detención de G2, pero se cree que diferentes proteínas mantienen la detención de G2 para que pueda ocurrir una reparación suficiente del ADN. Una de esas proteínas es rad18 que se requiere para la detención de G2 incluso cuando Chk1 está fosforilada y activa. Por lo tanto, se requiere rad18 para el mantenimiento del punto de control G2 / M, mientras que se requiere Chk1 para el inicio del punto de control. [16] Esto se ve reforzado por su función adicional en la reparación del ADN, específicamente en el mantenimiento de las estructuras cromosómicas. Su necesidad se demuestra por el hecho de que en ausencia de rad18, el ADN no puede repararse incluso cuando la detención de G2 se prolonga por otros medios.
El mantenimiento de tal detención en la fase G2 es sostenido además por p53 y p21. En ausencia de p53 o p21, se demostró que las células irradiadas progresaban hacia la mitosis. [17] La ausencia de p21 o 14-3-3 no puede inhibir suficientemente el complejo CyclinB-Cdc2, exhibiendo así el control regulador de p53 y p21 en el punto de control G2 en respuesta al daño del ADN. [12] Las mutaciones de p53 pueden resultar en un déficit significativo en el punto de control, lo que tiene importantes implicaciones en el tratamiento del cáncer.
Inactivación del punto de control
La inactivación de ambos Wee1 y Cdc25 suprime el punto de control de daños M-G2 ADN. La ausencia de Wee1 o la eliminación del sitio de tirosina-15 elimina la regulación negativa de la actividad de Cdc2 y hace que las células entren en mitosis sin completar la reparación, lo que anula efectivamente el punto de control G2-M. [18] La ausencia de Cdc25 detiene las células en G2, pero aún permite la activación del punto de control G2-M, lo que implica que tanto la activación de Wee1 como la desactivación de Cdc25 son pasos reguladores importantes en el punto de control. [11]
La inactivación de Chk1 es suficiente para superar el punto de control y promover la entrada en la mitosis, independientemente de si se repara el daño del ADN. Sin embargo, todavía se sabe poco sobre el mecanismo exacto con respecto a la terminación del punto de control con posibles mecanismos que incluyen proteínas fosfatasas que invierten las fosforilaciones activadoras, degradación de ubiquitina dirigida de proteínas activadoras y antagonistas del punto de control que promueven la mitosis a través de vías independientes. [10]
Cáncer
Se ha descubierto que muchos reguladores del ciclo celular como Cdks, ciclinas y p53 tienen una expresión anormal en el cáncer. Más específicamente, se les ha implicado en participar en la transición G2 / M mediante la localización en el centrosoma, lo que conduce a estudios sobre la manipulación de dichas proteínas con el fin de mejorar la sensibilidad del cáncer a la radiación y la quimioterapia. [13] Chk1 tiene implicaciones importantes en la selección de fármacos contra el cáncer, ya que su función actúa en respuesta al daño del ADN. Los efectos citotóxicos de la quimioterapia se están estudiando actualmente en la modulación de la transición G2 / M, tanto en lo que respecta a la abrogación como a la detención del punto de control. [19] Muchas terapias se centran en inactivar el punto de control para obligar a las células con un exceso de daño en el ADN a pasar por la mitosis e inducir la muerte celular. [12]
Referencias
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