El sistema Strep-tag® es un método que permite la purificación y detección de proteínas mediante cromatografía de afinidad . El Strep-tag II es un péptido sintético que consta de ocho aminoácidos ( Trp - Ser - His - Pro - Gln - Phe - Glu - Lys ). Esta secuencia de péptidos exhibe afinidad intrínseca hacia Strep-Tactin®, una estreptavidina diseñada específicamente , y puede fusionarse N- o C- terminalmente con proteínas recombinantes. Al explotar la interacción altamente específica, StrepLas proteínas marcadas con etiquetas pueden aislarse en un solo paso a partir de lisados celulares brutos. Debido a que el Strep -tag eluye en condiciones fisiológicas suaves, es especialmente adecuado para la generación de proteínas funcionales. [1] [2]
Desarrollo y bioquímica del Strep-tag
La estreptavidina es una proteína tetramérica expresada en Streptomyces avidinii . Debido a su alta afinidad por la vitamina h- biotina , la estreptavidina se usa comúnmente en los campos de la biología molecular y la biotecnología . La etiqueta Strep se seleccionó originalmente de una biblioteca genética para unirse específicamente a una versión "central" truncada proteolíticamente de estreptavidina. A lo largo de los años, el Strep-tag se optimizó sistémicamente para permitir una mayor flexibilidad en la elección del sitio de conexión. Además, su socio de interacción, Streptavidin, también se optimizó para aumentar la capacidad de unión de péptidos, lo que resultó en el desarrollo de Strep-Tactin. La afinidad de unión de Strep-tag a Strep-Tactin es casi 100 veces mayor que a Streptavidin. El llamado sistema Strep-tag, que consta de Strep-tag y Strep-Tactin, ha demostrado ser particularmente útil para el aislamiento funcional y el análisis de complejos de proteínas en la investigación de proteomas . [3]
El principio de Strep-tag
Al igual que otras etiquetas corto de afinidad ( His-tag , FLAG-tag ), la etiqueta Strep puede fusionarse fácilmente a recombinantes proteínas durante la subclonación de su cDNA o gen . Para su expresión, se encuentran disponibles varios vectores para diversos organismos hospedadores ( E. coli , levaduras , insectos y células de mamíferos ). [4] Un beneficio particular del Strep-tag es su tamaño bastante pequeño y el hecho de que es bioquímicamente casi inerte . Por lo tanto, el plegamiento o la secreción de proteínas no se ven afectados y, por lo general, no interfieren con la función de las proteínas. Strep-tag es especialmente adecuado para el análisis de proteínas funcionales, porque el procedimiento de purificación se puede mantener en condiciones fisiológicas. Esto no solo permite el aislamiento de proteínas sensibles en un estado nativo, sino que también es posible purificar complejos de proteínas intactos, [5] incluso si solo una subunidad lleva la etiqueta.
En el primer paso del ciclo de purificación de Strep-tag, el lisado celular que contiene la proteína de fusión Strep-tag se aplica a una columna con Strep-Tactin inmovilizado (paso 1). Una vez que la proteína etiquetada se ha unido específicamente a Strep-Tactin, un breve paso de lavado con un tampón fisiológico (por ejemplo, PBS) elimina todas las demás proteínas del huésped (paso 2). Esto se debe a su extraordinaria baja tendencia a unirse a proteínas de forma no específica. Luego, la proteína de fusión Strep-tag purificada se eluye suavemente con una baja concentración de destiobiotina , que compite específicamente por el bolsillo de unión de biotina (paso 3). Para regenerar la columna, se elimina la desthiobiotin mediante la aplicación de una solución que contiene HABA (un colorante azoico amarillo ). La eliminación de desthiobiotin se indica mediante un cambio de color de amarillo-naranja a rojo (paso 4 + 5). Finalmente, la solución de HABA se lava con un pequeño volumen de tampón de ejecución, lo que deja la columna lista para usar en la siguiente ejecución de purificación.
Aplicaciones de Strep-tag
El sistema Strep-tag ofrece una herramienta altamente selectiva para purificar proteínas en condiciones fisiológicas. Las proteínas obtenidas son bioactivas y presentan una pureza muy elevada (superior al 95%). Además, el sistema Strep-tag se puede utilizar para la detección de proteínas en varios ensayos. Dependiendo de las circunstancias experimentales, anticuerpos Strep-tag o Strep-Tactin, con un marcador enzimático (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina (AP)) o de fluorescencia (por ejemplo, proteína verde fluorescente (GFP)). Si se requiere una alta pureza, el lisado se puede purificar usando primero Strep-Tactin y luego realizar una segunda ejecución usando anticuerpos contra Strep-tag. Esto reduce la contaminación con proteínas unidas inespecíficas, lo que podría ocurrir en algunos escenarios raros.
Se pueden realizar los siguientes ensayos utilizando el sistema de detección de Strep-tag:
- purificación por afinidad en un solo paso
- Proteína: estudios de interacción de proteínas
- Transferencia de colonias , transferencia de puntos , transferencia de Western y ELISA
- Detección de clones de expresión positiva
- Inmunocitoquímica e inmunohistoquímica
- Estudios de localización y focalización de proteínas
Debido a que Strep-tag es capaz de aislar complejos de proteínas, también se pueden llevar a cabo estrategias para el estudio de interacciones proteína-proteína. Otra opción es la inmovilización de proteínas Strep-tag con un anticuerpo específico de alta afinidad en microplacas o biochips.
El sistema Strep-Tag / StrepTactin también se usa en pinzas ópticas de una sola molécula y experimentos AFM, mostrando una alta estabilidad mecánica comparable a los enlaces no covalentes más fuertes actualmente disponibles. [6]
Ver también
Referencias
- ^ Schmidt, Thomas GM; Skerra, Arne (2007). "El sistema Strep-tag para purificación en un solo paso y detección o captura de proteínas de alta afinidad". Protocolos de la naturaleza . 2 (6): 1528–35. doi : 10.1038 / nprot.2007.209 . PMID 17571060 .
- ^ Skerra, A; Schmidt, TG (2000). "Uso de Strep-Tag y estreptavidina para la detección y purificación de proteínas recombinantes". Métodos en enzimología . Métodos en enzimología. 326 : 271-304. doi : 10.1016 / S0076-6879 (00) 26060-6 . ISBN 978-0-12-182227-9. PMID 11036648 .
- ^ Ostermeier, cristiano; Harrenga, Axel; Ermler, Ulrich; Michel, Hartmut (1997). "Estructura a una resolución de 2,7 Å de la citocromo c oxidasa de dos subunidades de Paracoccus denitrificans complejada con un fragmento de anticuerpo F V " . Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 94 (20): 10547–53. doi : 10.1073 / pnas.94.20.10547 . PMC 23397 . PMID 9380672 .
- ^ [1]
- ^ Junttila, Melissa R .; Saarinen, Susanna; Schmidt, Thomas; Kast, Juergen; Westermarck, Jukka (2005). "Purificación de Strep-tag en un solo paso para el aislamiento e identificación de complejos de proteínas de células de mamíferos". Proteómica . 5 (5): 1199–203. doi : 10.1002 / pmic.200400991 . PMID 15761952 .
- ^ Moayed F, Mashaghi A, Tans SJ (2013) Un híbrido de polipéptido-ADN con capacidad de vinculación selectiva aplicada a mediciones nanomecánicas de una sola molécula con pinzas ópticas. PLoS ONE 8 (1): e54440. doi: 10.1371 / journal.pone.0054440 [2]
enlaces externos
- La etiqueta Strep