Los transposones son semi- parasitarias de ADN secuencias que pueden replicarse y propagarse a través del huésped genoma . Pueden utilizarse como una herramienta genética para el análisis de la función de genes y proteínas . El uso de transposones está bien desarrollado en Drosophila (en el que los elementos P se usan con mayor frecuencia) y en el berro Thale ( Arabidopsis thaliana ) y bacterias como Escherichia coli ( E. coli ). [1] [2]
Actualmente, los transposones pueden usarse en investigación genética e ingeniería genética recombinante para mutagénesis de inserción . La mutagénesis de inserción es cuando los transposones funcionan como vectores para ayudar a eliminar e integrar secuencias genéticas. Dado su diseño relativamente simple y su capacidad inherente para mover secuencias de ADN, los transposones son altamente compatibles en la transducción de material genético, lo que los convierte en herramientas genéticas ideales.
Mutagénesis de marcado de firmas
La mutagénesis de etiquetado de firmas (también conocida como STM) es una técnica centrada en el uso de la inserción de elementos transponibles para determinar el fenotipo de un locus en el genoma de un organismo. Si bien las técnicas de secuenciación genética pueden determinar el genotipo de un genoma, no pueden determinar la función o la expresión fenotípica de las secuencias de genes. [3] [4] STM puede evitar este problema al mutar un locus, provocando que forme un nuevo fenotipo; comparando las expresiones fenotípicas observadas del locus mutado y no alterado, se puede deducir la expresión fenotípica del locus.
En STM, los transposones especialmente marcados se insertan en un organismo, como una bacteria, y se integran al azar en el genoma del huésped. En teoría, el organismo mutante modificado debería expresar el gen alterado, alterando así el fenotipo. Si se observa un nuevo fenotipo, se secuencia el genoma y se buscan transposones marcados. [3] Si se encuentra el sitio de integración del transposón, entonces el locus puede ser responsable de expresar los fenotipos. [5] [6]
Se han realizado muchos estudios STM basados en transposones, sobre todo con los elementos P [4] en Drosophila . Los elementos P son transposones descritos originalmente en el genoma de Drosophila melanogaster capaces de sintetizarse artificialmente o diseminarse a otras especies de Drosophila mediante transferencia horizontal. [4] En ensayos experimentales, los elementos P creados artificialmente y los genes de transposasa se insertan en los genomas de embriones de Drosophila . Posteriormente, se secuencian y comparan los genomas de los embriones que exhiben mutaciones, revelando así los loci que han sido afectados por la inserción y las funciones de los loci., [4] [6]
Inactivación insercional
La inactivación por inserción se centra en suprimir la expresión de un gen interrumpiendo su secuencia con una inserción. Cuando se insertan nucleótidos adicionales cerca o dentro de un locus, el locus puede sufrir una mutación de cambio de marco que podría evitar que se exprese correctamente en la cadena polipeptídica . La inactivación por inserción basada en transposones se considera para la investigación médica, desde la supresión de la resistencia a los antibióticos en las bacterias hasta el tratamiento de enfermedades genéticas . [7] En el tratamiento de enfermedades genéticas, la inserción de un transposón en el locus del gen deletéreo del genoma del organismo desalinearía la secuencia del locus, truncando las proteínas dañinas formadas y haciéndolas no funcionales. Alternativamente, la inactivación por inserción podría usarse para suprimir genes que expresan resistencia a antibióticos en bacterias., [7] [8]
Bella Durmiente
Si bien los transposones se han utilizado con éxito en plantas y sujetos invertebrados a través de mutagénesis de inserción y activación de inserción, el uso de transposones en vertebrados se ha limitado debido a la falta de transposones específicos de vertebrados. Casi todos los transposones compatibles y presentes en los genomas de vertebrados están inactivos y, a menudo, se relegan a ADN "basura". [6] Sin embargo, es posible identificar transposones inactivos y recrearlos artificialmente como agentes activos. [6] Los investigadores genéticos Zsuzsanna Izsvák y Zoltán Ivics descubrieron una secuencia de transposones de peces que, a pesar de estar inactiva durante 15 millones de años, podría resucitar como vector para introducir genes extraños en los genomas de vertebrados, incluidos los humanos. Este transposón, llamado La Bella Durmiente, se describió en 1997 y podría reactivarse artificialmente en un transposón funcional. [6]
La Bella Durmiente también puede ser viable en los procedimientos de terapia génica al ayudar a introducir transgenes beneficiosos en los genomas del huésped. Belcher y col. probó esta noción usando transposones de La Bella Durmiente para ayudar a insertar secuencias en ratones con anemia de células falciformes para que puedan producir las enzimas necesarias para contrarrestar su anemia. [6] Belcher y col. comenzaron su experimento construyendo una secuencia genética que consiste en el elemento transponible Hmox-1 y la transposasa de La Bella Durmiente. Esta secuencia se añadió luego insertada en un plásmido y se introdujo en las células de los ratones. La transposasa de Sleeping Beauty ayudó a insertar el transposón Hmox-1 en el genoma de los ratones, lo que permitió la producción de la enzima hemo oxigenasa-1 (HO-1). Los ratones que recibieron la inserción mostraron un aumento de cinco veces en la expresión de HO-1, que a su vez redujo el bloqueo de los vasos sanguíneos por anemia de células falciformes. La publicación del experimento en 2010 mostró que los transposones pueden ser útiles en la terapia génica. [6]
Elementos P como herramienta ( Drosophila )
Los elementos P naturales contienen:
- secuencia codificante de la enzima transposasa ;
- secuencias de reconocimiento para la acción de la transposasa.
La transposasa es una enzima que regula y cataliza la escisión de un elemento P del ADN del huésped, cortando en dos sitios de reconocimiento y luego reinserta el elemento P al azar. Es el proceso de inserción aleatoria, que puede interferir con los genes existentes, o llevar un gen adicional, que puede usarse como un proceso para la investigación genética.
Para utilizar este proceso como una herramienta genética útil y controlable, las dos partes del elemento P deben estar separadas para evitar la transposición incontrolada. Por tanto, las herramientas genéticas normales son:
- ADN que codifica transposasa (u ocasionalmente simplemente transposasa) sin secuencias de reconocimiento de transposasa, por lo que no puede insertarse; y
- un "Plásmido P".
Los plásmidos P siempre contienen:
- un gen indicador de Drosophila , a menudo un marcador de ojos rojos (producto del gen blanco );
- secuencias de reconocimiento de transposasas;
y puede contener:
- un gen de interés;
- un gen informador de E. coli (a menudo algún tipo de resistencia a los antibióticos ); y
- origen de replicación y otras secuencias asociadas de "mantenimiento" del plásmido .
Métodos de uso ( Drosophila )
(Métodos de genética avanzada) Hay dos formas principales de utilizar estas herramientas: Transformación de moscas y Mutagénesis por inserción, cada una de las cuales se describe a continuación.
Transformación de moscas
(esperando inserción en regiones no codificantes)
- Microinyecte el extremo posterior de un embrión en etapa temprana (precelularización) con codificación para transposasa y un plásmido con el gen reportero, gen de interés y secuencias de reconocimiento de transposasa.
- Se produce una transposición aleatoria que inserta el gen de interés y el gen informador.
- Cultiva moscas y cruza para eliminar la variación genética entre las células del organismo. (Solo se habrán transformado algunas de las células del organismo. Al criar solo se transmite el genotipo de los gametos, eliminando esta variación).
- Busque moscas que expresen el gen reportero. Estos portan el gen de interés insertado, por lo que pueden investigarse para determinar el fenotipo debido al gen de interés.
Es importante señalar que el gen insertado puede haber dañado la función de uno de los genes del huésped. Se requieren varias líneas de moscas para que se pueda realizar la comparación y garantizar que no se hayan eliminado genes adicionales.
Mutagénesis insercional
(esperando inserción en la región de codificación)
- Microinyectar el embrión con la codificación de la transposasa y un plásmido con el gen indicador y las secuencias de reconocimiento de la transposasa (y a menudo el gen indicador de E. coli y el origen de la replicación, etc.).
- Se produce una transposición aleatoria, insertando el gen informador de forma aleatoria. La inserción tiende a ocurrir cerca de genes transcritos activamente, ya que aquí es donde la estructura de la cromatina es más suelta, por lo que el ADN es más accesible.
- Cultiva moscas y cruza para eliminar la variación genética entre las células del organismo (ver arriba).
- Busque moscas que expresen el gen reportero. Estos han experimentado una transposición exitosa, por lo que pueden investigarse para determinar el fenotipo debido a la mutación de genes existentes.
Posibles mutaciones:
- Inserción en una región traducida => proteína híbrida / proteína truncada. Suele provocar pérdida de la función proteica, aunque se observan efectos más complejos.
- Inserción en un intrón => patrón de empalme alterado / falla de empalme. Por lo general, da como resultado el truncamiento de proteínas o la producción de productos inactivos mal empalmados, aunque son comunes los efectos más complejos.
- Inserción en 5 '(la secuencia que se convertirá en el ARNm 5' UTR) región no traducida => truncamiento de la transcripción. Por lo general, da como resultado que el ARNm no contenga un límite 5 ' , lo que conduce a una traducción menos eficiente.
- Inserción en promotor => reducción / pérdida completa de expresión. Siempre resulta en niveles de producción de proteínas muy reducidos. El tipo de inserción más útil para el análisis por la sencillez de la situación.
- Inserción entre el promotor y los potenciadores ascendentes => pérdida de la función potenciadora / secuestro de la función potenciadora del gen indicador. † Generalmente reduce el nivel de especificidad de la proteína para el tipo de célula, aunque a menudo se observan efectos complejos.
† Atrapamiento potenciador
El secuestro de un potenciador de otro gen permite el análisis de la función de ese potenciador. Esto, especialmente si el gen reportero es para una proteína fluorescente, puede usarse para ayudar a mapear la expresión del gen mutado a través del organismo y es una herramienta muy poderosa.
Otro uso de elementos P ( Drosophila )
(Método de genética inversa)
Movilización secundaria
Si hay un elemento P antiguo cerca del gen de interés (con una transposasa rota), puede removilizarlo mediante microinyección del embrión con la codificación de la transposasa o la transposasa misma. El elemento P a menudo se transpondrá dentro de unas pocas kilobases de la ubicación original, lo que con suerte afectará su gen de interés como para la 'mutagénesis de inserción'.
Análisis de productos de mutagénesis ( Drosophila )
Una vez que se ha determinado la función de la proteína mutada, es posible secuenciar / purificar / clonar las regiones que flanquean la inserción mediante los siguientes métodos:
PCR inversa
- Aislar el genoma de la mosca.
- Someterse a una digestión ligera (usando una enzima [enzima 1] que se sabe que NO corta el gen reportero), dando fragmentos de unas pocas kilobases, algunas con la inserción y su ADN flanqueante.
- Autoliga la digestión (baja concentración de ADN para asegurar la autoligación) dando una selección de fragmentos circulares de ADN, algunos con la inserción y su ADN flanqueante.
- Cortar los plásmidos en algún punto del gen informador (con una enzima [enzima 2] que se sabe que corta muy raramente en el ADN genómico, pero que se sabe que en el gen informador).
- Utilizando cebadores para las secciones del gen indicador, el ADN se puede amplificar para secuenciar .
El proceso de corte, autoligación y re-corte permite la amplificación de las regiones flanqueantes del ADN sin conocer la secuencia. El punto en el que se produjo la ligadura puede verse identificando el sitio de corte de la [enzima 1].
Rescate de plásmido ( transformación de E. coli )
- Aislar el genoma de la mosca.
- Someterse a una digestión ligera (utilizando una enzima [enzima 1] que se sabe que corta el límite entre el gen reporter y el gen reporter de E. coli y las secuencias de plásmido), dando fragmentos de unas pocas kilobases, algunas con el reporter de E. coli , las secuencias de plásmido y su ADN flanqueante.
- Autoliga la digestión (baja concentración de ADN para asegurar la autoligación) dando una selección de fragmentos de ADN circulares, algunos con el reportero de E. coli , las secuencias de plásmido y su ADN flanqueante.
- Inserte los plásmidos en células de E. coli (por ejemplo, mediante electroporación).
- Cribar plásmidos para el gen indicador de E. coli. Solo los insertos exitosos de plásmidos con las secuencias de "mantenimiento" del plásmido expresarán este gen.
7. El gen se puede clonar para su posterior análisis.
Aplicación de elementos transponibles Otros organismos
Los genomas de otros organismos se pueden analizar de forma similar, aunque con diferentes elementos transponibles. El reciente descubrimiento del ' transposón marinero ' (a partir de la reconstrucción de la secuencia original de muchas versiones 'muertas' en el genoma humano) ha permitido muchos experimentos nuevos, mariner tiene homólogos bien conservados en una amplia gama de especies y es muy versátil herramienta.
Referencias
Este artículo incorpora material del artículo de Citizendium "Los transposones como herramienta genética ", que está bajo la licencia Creative Commons Attribution-ShareAlike 3.0 Unported pero no bajo la GFDL .
- ^ Beckwith, J .; Silhavy, TJ (1992). El poder de la genética bacteriana: un curso basado en la literatura . Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. págs. 555–614. ISBN 0-87969-411-4.
- ^ Kleckner N, Roth J, Botstein D (octubre de 1977). "Ingeniería genética in vivo utilizando elementos translocables de resistencia a fármacos. Nuevos métodos en genética bacteriana". J. Mol. Biol . 116 (1): 125–59. doi : 10.1016 / 0022-2836 (77) 90123-1 . PMID 338917 .
- ^ a b Berg, Claire; Berg, Douglass E. "Herramientas de elementos transponibles para la genética microbiana" . EcoSal.
- ^ a b c d Engels, William R. "Elementos P en Drosophila" . Departamento de Genética, Universidad de Wisconsin. Archivado desde el original el 11 de enero de 2006.
- ^ Ivics Z, Li MA, Mátés L, et al. (Junio de 2009). "Manipulación del genoma mediada por transposones en vertebrados" . Nat. Métodos . 6 (6): 415-22. doi : 10.1038 / nmeth.1332 . PMC 2867038 . PMID 19478801 .
- ^ a b c d e f g Luft FC (julio de 2010). "La Bella Durmiente salta a nuevas alturas" . J. Mol. Med . 88 (7): 641–3. doi : 10.1007 / s00109-010-0626-1 . PMID 20467721 .
- ^ a b Berger-Bächi B (abril de 1983). "Inactivación de inserción de resistencia a meticilina estafilocócica por Tn551" . J. Bacteriol . 154 (1): 479–87. PMC 217482 . PMID 6300037 .
- ^ Zoltaná Ivics; Meng Amy Li; Lajos Mates; Jef D. Boeke; Allan Bradley (junio de 2009). "Manipulaciones del genoma mediadas por transposones en vertebrados" . Nat. Métodos . 6 (6): 415-22. doi : 10.1038 / nmeth.1332 . PMC 2867038 . PMID 19478801 .
Otras lecturas
- Snyder, L .; Champness, W. (2003). "Capítulo 9: Transposición y recombinación específica de sitio". Genética molecular de bacterias (2ª ed.). Washington DC: Prensa de ASM. págs. 303–340 . ISBN 1-55581-204-X.
- "Bibliografía: Transposones como herramienta genética" . Citizendium.org.
- Ver Martienssen, RA; Springer, PS "Mutagénesis del transposón potenciador y trampa genética en Arabidopsis" . Laboratorio de Cold Spring Harbor.