La síntesis de oligonucleótidos es la síntesis química de fragmentos relativamente cortos de ácidos nucleicos con estructura química definida ( secuencia ). La técnica es extremadamente útil en la práctica de laboratorio actual porque proporciona un acceso rápido y económico a oligonucleótidos personalizados de la secuencia deseada. Mientras que las enzimas sintetizan ADN y ARN solo en una dirección 5 'a 3' , la síntesis química de oligonucleótidos no tiene esta limitación, aunque con mayor frecuencia se lleva a cabo en la dirección opuesta, 3 'a 5'. Actualmente, el proceso se implementa como síntesis en fase sólida utilizando fosforamidita.método y bloques de construcción de fosforamidita derivados de 2'-desoxinucleósidos protegidos ( dA , dC , dG y T ), ribonucleósidos ( A , C , G y U ) o nucleósidos modificados químicamente, por ejemplo, LNA o BNA .
Para obtener el oligonucleótido deseado, los bloques de construcción se acoplan secuencialmente a la cadena de oligonucleótidos en crecimiento en el orden requerido por la secuencia del producto (ver Ciclo sintético a continuación). El proceso ha sido completamente automatizado desde finales de la década de 1970. Una vez completado el montaje de la cadena, el producto se libera de la fase sólida a la solución, se desprotege y se recoge. La aparición de reacciones secundarias establece límites prácticos para la longitud de los oligonucleótidos sintéticos (hasta aproximadamente 200 residuos de nucleótidos ) porque el número de errores se acumula con la longitud del oligonucleótido que se sintetiza. [1] Los productos a menudo se aíslan mediante cromatografía líquida de alta resolución.(HPLC) para obtener los oligonucleótidos deseados con alta pureza. Por lo general, los oligonucleótidos sintéticos son moléculas de ADN o ARN de una sola hebra de alrededor de 15 a 25 bases de longitud.
Los oligonucleótidos encuentran una variedad de aplicaciones en biología molecular y medicina. Se utilizan con mayor frecuencia como oligonucleótidos antisentido , pequeños ARN de interferencia , cebadores para la secuenciación y amplificación del ADN , sondas para detectar ADN o ARN complementarios mediante hibridación molecular , herramientas para la introducción dirigida de mutaciones y sitios de restricción , y para la síntesis de genes artificiales .
La evolución de la síntesis de oligonucleótidos vio cuatro métodos principales de formación de enlaces internucleosídicos y se ha revisado en la literatura con gran detalle. [2] [3] [4]
A principios de la década de 1950, el grupo de Alexander Todd fue pionero en los métodos de síntesis de oligonucleótidos de triéster de fosfonato y fosfato . [5] [6] La reacción de los compuestos 1 y 2 para formar el diéster 3 de H-fosfonato es un acoplamiento de H-fosfonato en solución mientras que la de los compuestos 4 y 5 para dar 6 es un acoplamiento de fosfotriéster (ver la síntesis de fosfotriéster a continuación).
Treinta años después, este trabajo inspiró, de forma independiente, a dos grupos de investigación a adoptar la química del H-fosfonato a la síntesis en fase sólida utilizando monoésteres de nucleósido H-fosfonato 7 como componentes básicos y cloruro de pivaloilo, cloruro de 2,4,6-triisopropilbencenosulfonilo (TPS). -Cl), y otros compuestos como activadores. [7] [8] La implementación práctica del método de H-fosfonato resultó en un ciclo sintético muy corto y simple que constaba de solo dos pasos, detritilación y acoplamiento (Esquema 2). Oxidación de enlaces de diéster de H-fosfonato internucleosídico en 8 a enlaces de fosfodiéster en 9 con una solución de yodo en piridina acuosase lleva a cabo al final del ensamblaje de la cadena y no como un paso en el ciclo sintético. Si se desea, la oxidación se puede realizar en condiciones anhidras. [9] Alternativamente, 8 se puede convertir en fosforotioato 10 [10] [11] [12] [13] o fosforoselenoato 11 (X = Se), [14] o se puede oxidar por CCl 4 en presencia de aminas primarias o secundarias para análogos de fosforamidato 12 . [15] [16]El método es muy conveniente porque se pueden introducir varios tipos de modificaciones de fosfato (fosfato / fosforotioato / fosforamidato) en el mismo oligonucleótido para modular sus propiedades. [17] [18] [19]