Las vesículas extracelulares (VE) son partículas delimitadas por bicapas lipídicas que se liberan naturalmente de una célula y, a diferencia de una célula, no pueden replicarse. Los vehículos eléctricos varían en diámetro desde casi el tamaño del liposoma unilaminar más pequeño físicamente posible (alrededor de 20-30 nanómetros ) hasta 10 micrones o más, aunque la gran mayoría de los vehículos eléctricos son más pequeños que 200 nm. Llevan una carga de proteínas , [1] ácidos nucleicos , lípidos , metabolitos e incluso orgánulos de la célula madre. Se cree que la mayoría de las células que se han estudiado hasta la fecha liberan vehículos eléctricos, incluidas algunascélulas arqueales , bacterianas , fúngicas y vegetales que están rodeadas por paredes celulares . Se ha propuesto una amplia variedad de subtipos de EV, definidos de diversas formas por tamaño, vía de biogénesis , carga, fuente celular y función, lo que lleva a una nomenclatura históricamente heterogénea que incluye términos como exosomas y ectosomas .
Se han establecido o postulado numerosas funciones de los vehículos eléctricos. La primera evidencia de la existencia de vehículos eléctricos fue posible gracias a la ultracentrífuga , el microscopio electrónico y los estudios funcionales de la coagulación a mediados del siglo XX. En la primera década del siglo XXI se produjo un fuerte aumento en el interés por los vehículos eléctricos tras el descubrimiento de que los vehículos eléctricos podían transferir ácidos nucleicos como el ARN de una célula a otra. Asociados con EV de ciertas células o tejidos , los ácidos nucleicos podrían amplificarse fácilmente como marcadores de enfermedad y también podrían rastrearse hasta una célula de origen, como una célula tumoral . El descubrimiento también implicó que los vehículos eléctricos podrían usarse con fines terapéuticos, como administrar ácidos nucleicos u otra carga al tejido enfermo. Este creciente interés fue acompañado por la formación de empresas y programas de financiación centrados en el desarrollo de vehículos eléctricos como biomarcadores o terapias de enfermedades, la fundación de una Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares (ISEV) y el establecimiento de una revista científica dedicada al campo, la Revista. de vesículas extracelulares .
Antecedentes / Historia
La evidencia de la existencia de los vehículos eléctricos y sus funciones se recopiló por primera vez mediante aplicaciones combinadas de ultracentrifugación , microscopía electrónica y estudios funcionales a mediados del siglo XX. [2] Erwin Chargaff y Randolph West reportaron que los gránulos ultracentrifugados de plasma sanguíneo tienen propiedades procoagulantes en 1946. [3] La derivación plaquetaria y la naturaleza que contiene lípidos de estas partículas fue articulada adicionalmente por Peter Wolf . [4] Casi al mismo tiempo, H. Clarke Anderson y Ermanno Bonucci describieron por separado las propiedades calcificantes de los vehículos eléctricos en la matriz ósea. [5] [6]
Aunque las propiedades extracelulares y vesiculares de los vehículos eléctricos habían sido reconocidas por numerosos grupos en la década de 1970, el término "vesícula extracelular" se utilizó por primera vez en el título de un manuscrito en 1971. [6] Este estudio de microscopía electrónica del alga flagelada de agua dulce 'Ochromonas danica' informó la liberación de vehículos eléctricos de las membranas, incluidas las de los flagelos . Poco después, se observó que los EV se liberaban de las células tiroideas foliculares del murciélago durante el despertar de la hibernación , lo que sugiere la posible participación de los EV en los procesos endocrinos . [7] Los informes de VE en muestras de vellosidades intestinales y, por primera vez, en material de cáncer humano ( adenoma ) [8] [9] [10] [11] se remitieron a publicaciones incluso anteriores que proporcionaron pruebas similares, aunque las conclusiones sobre el lanzamiento de EV no se había elaborado. Los EV también se describieron en suero bovino y medio acondicionado de cultivo celular [11] [10] con distinciones hechas entre "vesículas del cuerpo multivesicular" y "microvesículas". [11] [2] Estos estudios observaron además las similitudes de los vehículos eléctricos y los virus envueltos.
A principios y mediados de la década de 1980, los laboratorios de Stahl y Johnstone forjaron una comprensión más profunda de la liberación de vehículos eléctricos de los reticulocitos, [12] [13] [14] mientras que también se avanzó en los vehículos eléctricos desprendidos de las células tumorales. [15] [2] La investigación de los reticulocitos, en particular, mostró que los VE podrían liberarse no solo de la membrana plasmática o de la superficie de la célula, sino también mediante la fusión del cuerpo multivesicular con la membrana plasmática. Durante este tiempo, los EV se describieron con muchos nombres, a veces en el mismo manuscrito, como "vesículas desprendidas", "fragmentos de membrana", "vesículas de membrana plasmática", "micro-vesículas / microvesículas", "exosomas" (anteriormente utilizado para elementos móviles y transformadores de ADN en organismos modelo Drosophila y Neurospora [16] [17] ), "vesículas de inclusión" y más, o se denominan por órgano de origen, como "prostasomas" que se encontró que mejoran la motilidad de los espermatozoides en el semen . [18] [2]
La participación de los vehículos eléctricos en las respuestas inmunitarias se hizo cada vez más clara en la década de 1990 con los hallazgos del grupo de Graça Raposo y otros. [19] [2] Un ensayo clínico de vehículos eléctricos derivados de células dendríticas se realizó en Francia justo antes del cambio de siglo. [ citación necesitada ] Se encontró que las células del sistema inmunológico eran capaces de transferir proteínas transmembrana a través de vehículos eléctricos. Por ejemplo, el VIH co-receptores CCR5 y CXCR4 podrían ser transferidos de una célula de VIH-susceptible a una célula refractario por "micropartículas", que hacen que el permisivo célula receptora a la infección. [20] [21]
A partir de 2006, varios laboratorios informaron que los vehículos eléctricos contienen ácidos nucleicos y tienen la capacidad de transferirlos de una célula a otra. [22] [23] [24] [25] [26] [27] [2] Incluso se descubrió que algunos ARN funcionan en la célula receptora. Ya sea que transporten ARN, moléculas de superficie u otros factores, la participación de los vehículos eléctricos en la progresión del cáncer despertó un interés considerable, [28] lo que llevó a la hipótesis de que los vehículos eléctricos específicos podrían apuntar a células específicas debido a los "códigos" mostrados en su superficie; [29] crear o mejorar un nicho metastásico; [30] delatar la presencia de cánceres específicos; [31] o utilizarse como terapia para atacar las células cancerosas. [32] Mientras tanto, se lograron avances en la comprensión de la biogénesis y los subtipos de vesículas. [33] [34] [35] [36]
El rápido crecimiento de la comunidad de investigación de vehículos eléctricos a principios de la década de 2000 llevó a la creación de la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares (ISEV), que ha liderado los esfuerzos para el rigor y la estandarización en el campo, incluido el establecimiento de la Revista de Vesículas Extracelulares . También se ha formado una plétora de sociedades de vehículos eléctricos nacionales y regionales. En 2012, la Oficina del Director de los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU . (NIH) anunció un programa para la financiación de estudios de EV y ARN extracelular, el Consorcio de Comunicación de ARN Extracelular (ERCC), [37] que posteriormente invirtió> USD 100 millones en investigación de EV . En 2018 se anunció una segunda ronda de financiación. La inversión comercial en diagnósticos y terapias de vehículos eléctricos también creció durante este tiempo. Exosome Diagnostics ha desarrollado varios ensayos de diagnóstico de cáncer basados en parte en EV RNA. [ cita requerida ] Codiak Biosciences es una empresa con propiedad intelectual en el espacio del cáncer de páncreas. [ cita requerida ]
Biogénesis y nomenclatura
Se han propuesto diversos subtipos de EV, con nombres como ectosomas , microvesículas , micropartículas , exosomas , oncosomas , cuerpos apoptóticos , exómeros y más. [2] Estos subtipos de EV se han definido mediante varias definiciones, a menudo superpuestas, basadas principalmente en la biogénesis (vía celular, identidad celular o tisular, condición de origen). [38] Sin embargo, los subtipos de EV también pueden definirse por tamaño, moléculas constituyentes, función o método de separación. Debido a las definiciones desconcertantes y a veces contradictorias de los diferentes subtipos de EV, el consenso científico actual es que la nomenclatura preferida es “vesícula extracelular” y las variaciones de la misma, a menos que se pueda demostrar un origen biogenético específico. [38] Los subtipos de vehículos eléctricos pueden definirse mediante:
"a) características físicas de los vehículos eléctricos, como el tamaño (" vehículos eléctricos pequeños "(sEV) y" vehículos eléctricos medianos / grandes "(m / lEV), con rangos definidos, por ejemplo, respectivamente, <100 nm o <200 nm [pequeño], o> 200 nm [grande y / o media]) o densidad (baja, media, alta, con cada rango definido); b) composición bioquímica (EV CD63 + / CD81 +, EV teñidos con Anexina A5, etc.); o c) descripciones de afecciones o células de origen (EV de podocitos, EV hipóxicos, oncosomas grandes , cuerpos apoptóticos) ". [38]
Ectosomas / microvesículas / micropartículas (origen de la membrana plasmática)
Los términos "ectosoma", "microvesícula" (MV) y "micropartícula" (MP) se refieren a partículas liberadas de la superficie de las células. Especialmente en el campo de la investigación de plaquetas, MP ha sido la nomenclatura estándar. La formación de ectosomas puede resultar en algunos casos de procesos dirigidos y en otros de fuerzas de cizallamiento o adherencia del PM a una superficie.
Exosomas (origen endosómico)
La biogénesis del exosoma comienza con el pellizco de las invaginaciones endosómicas en el cuerpo multivesicular (MVB), formando vesículas intraluminales (ILV). Si el MVB se fusiona con la membrana plasmática, las ILV se liberan como "exosomas". La primera publicación en utilizar el término "exosoma" para vehículos eléctricos lo presentó como sinónimo de "micro-vesícula". [39] El término también se ha utilizado para vehículos eléctricos dentro de rangos de tamaño específicos, vehículos eléctricos separados mediante métodos específicos o incluso todos los vehículos eléctricos.
Cuerpos apoptóticos
Los cuerpos apoptóticos son EV que son liberados por células moribundas que sufren apoptosis . Dado que las células apoptóticas tienden a mostrar fosfatidilserina (PS) en la bicapa exterior de la membrana celular, los cuerpos apoptóticos tienden a exteriorizar la PS, aunque otros EV también pueden hacerlo. Los cuerpos apoptóticos pueden ser bastante grandes (micrones de diámetro) pero también pueden medir en el rango submicrométrico.
Grandes oncosomas, exópteros y otros vehículos eléctricos muy grandes
Además de los EV muy grandes liberados durante la apoptosis, las células cancerosas, las neuronas y otras células pueden producir EV del tamaño de una micra. Cuando son producidas por células cancerosas, estas partículas se denominan "oncosomas grandes" [40] [41] y pueden alcanzar 20 micrones o más de diámetro. Estos grandes vehículos eléctricos son prácticamente células, excepto que no tienen núcleos completos. Contienen un citoesqueleto funcional y fuentes de energía (mitocondrias), y pueden ser móviles, contribuyendo a la metástasis. [ cita requerida ] Otra clase de EV grande se ha observado en neuronas del organismo modelo C. elegans. [42] Cuando se inyecta un tinte, se observó que las neuronas secuestran el tinte en una parte de la célula y lo liberan en un EV grande denominado "exopher". [42] Se planteó la hipótesis de que este cuerpo era un mecanismo para la eliminación de material celular no deseado. Técnicamente, las plaquetas de ciertos vertebrados (que brotan de megacariocitos ), así como los glóbulos rojos (p. Ej., De humanos adultos) también cumplen la definición de consenso de VE. [38]
Virus envueltos
Los virus envueltos son un tipo de EV producido bajo la influencia de una infección viral. Es decir, el virión está compuesto por membranas celulares pero contiene proteínas y ácidos nucleicos producidos a partir del genoma viral. Algunos virus envueltos pueden infectar otras células incluso sin un virión funcional, cuando el material genómico se transfiere a través de EV. Ciertos virus no envueltos también pueden reproducirse con la ayuda de vehículos eléctricos. [43]
Exómeros
El "exómero" es un tipo de partícula descubierto recientemente que puede estar relacionado con EV en el rango de tamaño de los EV pequeños (separados por el fraccionamiento asimétrico de flujo de campo-flujo de cultivo celular [44] y plasma sanguíneo humano [45] [46] ) , la relación de los exómeros con los vehículos eléctricos queda por dilucidar. [47]
Separación y concentración de EV
El estudio de los vehículos eléctricos y su carga generalmente requiere la separación de una matriz biológica (como un fluido o tejido complejo) para que se puedan analizar los componentes exclusivos de los vehículos eléctricos. Se han utilizado muchos enfoques, que incluyen ultracentrifugación diferencial, ultracentrifugación en gradiente de densidad, cromatografía de exclusión por tamaño, ultrafiltración, electroforesis capilar, fraccionamiento de flujo de campo de flujo asimétrico y métodos de captura por afinidad / inmunoafinidad. [38] [48] [2] [45] [46] [49] Cada método tiene sus propios resultados de recuperación y pureza: es decir, qué porcentaje de EV de entrada se obtiene y la proporción de componentes EV "verdaderos" a co -Aislados. La separación de vehículos eléctricos también puede verse influenciada por variables preanalíticas. [50] [51] [52] [53]
Caracterización EV
Análisis EV a nivel de población
Las poblaciones de vehículos eléctricos separadas o concentradas pueden caracterizarse por varios medios. Concentración total de moléculas en categorías como proteína , lípido o ácido nucleico . Los recuentos totales de partículas en una preparación también se pueden estimar, por ejemplo, mediante técnicas de dispersión de luz. Cada tecnología de medición puede tener un rango de tamaño específico para una cuantificación precisa, y muchas tecnologías no detectan EV muy pequeños (<100 nm de diámetro). Las "huellas dactilares" moleculares de poblaciones se pueden obtener mediante tecnologías "ómicas" como proteómica, lipidómica y RNomics, o mediante técnicas como la espectroscopia Raman . Los niveles generales de moléculas únicas también se pueden medir en la población, como tetraspaninas , fosfatidilserina o especies de ARN. Se ha propuesto que la pureza de una preparación de EV se puede estimar examinando la proporción de una medición a nivel de población con respecto a otra, por ejemplo, la proporción de proteína total o lípido total a partículas totales.
Análisis de partículas individuales
Se necesitan métodos especializados para estudiar los vehículos eléctricos a nivel de una sola partícula. El desafío para cualquier método putativo de una sola partícula es identificar el EV individual como una sola partícula de bicapa lipídica y proporcionar información adicional como el tamaño, las proteínas de superficie o el contenido de ácido nucleico. Los métodos que se han utilizado con éxito para el análisis de un solo EV incluyen microscopía óptica y citometría de flujo (para EV grandes, generalmente> 200 nm), microscopía electrónica (sin límite inferior) y microscopía inmunoelectrónica, imágenes de reflectancia interferométrica de una sola partícula (hasta aproximadamente 40 nm) y citometría de nano flujo (también a 40 nm). Algunas tecnologías permiten el estudio de vehículos eléctricos individuales sin una separación previa extensa de una matriz biológica: para dar algunos ejemplos, microscopía electrónica y citometría de flujo.
Marcadores enriquecidos y empobrecidos
Para demostrar la presencia de EV en una preparación, así como el agotamiento relativo de partículas o moléculas no EV, se necesitan marcadores enriquecidos y agotados en EV: [54] Por ejemplo, las directrices MISEV2018 recomiendan:
- Al menos un marcador asociado a la membrana como evidencia de la bicapa lipídica (p. Ej., Una proteína tetraspanina)
- Al menos un marcador citoplasmático, pero idealmente asociado a la membrana, para mostrar que la partícula no es simplemente un fragmento de membrana.
- Al menos un marcador "negativo" o "agotado": un marcador "celular profundo", un marcador de una partícula no EV o una molécula soluble que no se cree que esté enriquecida en EV. [38]
Por lo general, pero no necesariamente, los marcadores enriquecidos o empobrecidos en EV son proteínas que pueden detectarse mediante Western blot, ELISA, espectrometría de masas u otros métodos ampliamente disponibles. Se cree que el análisis de marcadores agotados es particularmente importante, ya que de lo contrario no se puede afirmar la pureza de una preparación de EV. Sin embargo, la mayoría de los estudios de vehículos eléctricos anteriores a 2016 no respaldaron las afirmaciones de la presencia de vehículos eléctricos al mostrar marcadores enriquecidos, y <5% midió la presencia de posibles coaislados / contaminantes. [55] A pesar de la gran necesidad, la comunidad de investigación de vehículos eléctricos aún no dispone de una lista de contaminantes de vehículos eléctricos. Un estudio reciente sugirió la separación EV basada en gradiente de densidad de los biofluidos como una configuración experimental para compilar una lista de contaminantes para EV, basada en el análisis diferencial de fracciones enriquecidas con EV versus fracciones enriquecidas en proteínas solubles. [56] Proteínas solubles en sangre, la proteína Tamm-Horsfall (uromodulina) en orina o proteínas del núcleo , aparato de Golgi , retículo endoplásmico o mitocondrias en células eucariotas. Las últimas proteínas se pueden encontrar en vehículos eléctricos grandes o, de hecho, en cualquier vehículo eléctrico, pero se espera que estén menos concentradas en el vehículo eléctrico que en la célula. [38]
Funciones biológicas de los vehículos eléctricos
Se ha atribuido a los vehículos eléctricos una amplia variedad de funciones biológicas.
- "Eliminación de basura": eliminación de materiales no deseados
- Transferencia de proteínas funcionales
- Transferencia de ARN funcional
- Reciclaje molecular o "nutrición"
- Señalización a la célula receptora a través de receptores endosomales o de superficie celular
- Creación de un nicho metastásico para el cáncer.
- Buscando caminos a través del medio ambiente
- La detección de quórum
- Mediar la interacción huésped-comensal o parásito / patógeno
VE como biomarcadores y terapéutica
VE en enfermedad
Se cree que los vehículos eléctricos desempeñan un papel en la propagación de diferentes enfermedades. Los estudios han demostrado que las células tumorales envían vehículos eléctricos para enviar señales a las células residentes objetivo, lo que puede provocar la invasión del tumor y la metástasis. [57]
Los estudios in vitro de la enfermedad de Alzheimer han demostrado que los astrocitos que acumulan beta amiloide liberan EV que causan apoptosis neuronal . [58] El contenido de los vehículos eléctricos también se vio afectado por la exposición a la beta amiloide y se encontró una mayor ApoE en los vehículos eléctricos secretados por los astrocitos expuestos a la beta amiloide. [59]
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