HAT Medium ( hipoxantina - aminopterina - timidina medio ) es un medio de selección para el cultivo de células de mamífero, que se basa en la combinación de aminopterina , un fármaco que actúa como un potente folato inhibidor de metabolismo mediante la inhibición de la dihidrofolato reductasa , la hipoxantina (un purina derivado) y timidina (un desoxi nucleósido ) que son intermediarios en la síntesis de ADN . El truco es que aminopterina bloquea ADN de novo síntesis , que es absolutamente necesario para la división celularproceder, pero la hipoxantina y la timidina proporcionan a las células la materia prima para evadir el bloqueo (la "vía de rescate"), siempre que tengan las enzimas adecuadas , lo que significa tener copias funcionales de los genes que las codifican.
La enzima dihidrofolato reductasa , que produce tetrahidrofolato (THF) mediante la reducción de dihidrofolato, es bloqueada específicamente por aminopterina. El THF, que actúa en asociación con proteínas específicas , puede recibir unidades de carbono individuales que luego se transfieren a objetivos específicos.
Uno de los objetivos importantes para la reproducción celular es la timidilato sintasa , que crea el monofosfato de timidina (TMP) a partir del monofosfato de desoxiuridina (dUMP). Mediante reacciones de fosforilación adicionales , se puede utilizar TMP para producir trifosfato de timidina (TTP), uno de los cuatro precursores de nucleótidos que utilizan las ADN polimerasas para crear ADN . Sin el THF necesario para convertir el dUMP, no puede haber TTP y la síntesis de ADN no puede continuar, a menos que se pueda producir TMP a partir de otra fuente. La fuente alternativa es la timidina presente en el medio HAT que puede ser absorbida por las células y fosforilada por la timidina quinasa (TK) en TMP.
La síntesis de IMP (precursor de GMP y GTP, y de AMP y ATP) también requiere THF, y también puede omitirse. En este caso, la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT) reacciona a la hipoxantina absorbida del medio con PRPP , liberando pirofosfato , para producir IMP por una vía de rescate.
Por lo tanto, el uso de medio HAT para cultivo celular es una forma de selección artificial de células que contienen TK y HGPRT de trabajo. Los venenos que matan las células, pero a los que son inmunes si carecen de uno de estos genes, hacen posibles muchos refinamientos útiles del esquema. Por tanto, una célula que carece de TK es resistente a la bromodesoxiuridina (BrdU) y una célula que carece de HGPRT es resistente a la 6-tioguanina (6-TG) y la 8-azaguanina . Por tanto, la selección con uno de los dos últimos fármacos, seguida de medio HAT, producirá colonias revertidas . [1]
Aplicaciones
El medio HAT se utiliza para la preparación de anticuerpos monoclonales . [2] Este proceso se denomina tecnología de hibridomas . Los animales de laboratorio (por ejemplo, ratones) se exponen primero a un antígeno contra el que estamos interesados en aislar un anticuerpo . Una vez que se aíslan los esplenocitos del mamífero, las células B se fusionan con células de mieloma inmortalizadas , negativas para HGPRT, usando polietilenglicol o el virus Sendai . Las células fusionadas se incuban en el medio HAT . La aminopterina en el medio bloquea la vía de novo . Por lo tanto, las células de mieloma no fusionadas mueren, ya que no pueden producir nucleótidos por la vía de novo o de rescate. Las células B no fusionadas mueren porque tienen una vida útil corta. De esta forma, solo sobreviven los híbridos de células B y mieloma. Estas células producen anticuerpos (una propiedad de las células B) y son inmortales (una propiedad de las células de mieloma). A continuación, el medio incubado se diluye en placas de pocillos múltiples hasta tal punto que cada pocillo contiene solo 1 célula. Luego, se puede verificar el sobrenadante en cada pocillo para el anticuerpo deseado. Dado que los anticuerpos en un pocillo son producidos por la misma célula B, se dirigirán hacia el mismo epítopo y se conocen como anticuerpos monoclonales .
La producción de anticuerpos monoclonales fue inventada por primera vez por César Milstein y Georges JF Köhler , lo que les valió el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 1984, compartido con Niels Kaj Jerne .
Referencias
- ^ Holliday, R; Ho, T. "evidencia de silenciamiento de genes por metilación endógena" . Proc Natl Acad Sci USA . 95 : 8727–32. doi : 10.1073 / pnas.95.15.8727 . PMC 21144 . PMID 9671746 .
- ^ Harshil, Saradhara. "Biotechfront" .