Inhibidor de enzimas

Molécula que se une a una enzima y disminuye su actividad.

Una figura que compara los tres tipos de inhibidores de enzimas y cómo funcionan con respecto a los sitios de unión al sustrato y los sitios de unión de los inhibidores.

Un sitio de unión a enzima que normalmente se uniría al sustrato puede unirse alternativamente a un inhibidor competitivo , evitando el acceso al sustrato. La dihidrofolato reductasa es inhibida por el metotrexato que evita la unión de su sustrato, el ácido fólico . Sitio de unión en azul, inhibidor en verde y sustrato en negro. ( PDB : 4QI9 )

Un inhibidor de enzimas es una molécula que se une a una enzima y disminuye su actividad . Al unirse a los sitios activos de las enzimas, los inhibidores reducen la compatibilidad del sustrato y la enzima y esto conduce a la inhibición de la formación de complejos enzima-sustrato, evitando la catálisis de reacciones y disminuyendo (a veces a cero) la cantidad de producto producido por un reacción. Se puede decir que a medida que aumenta la concentración de inhibidores enzimáticos, la tasa de actividad enzimática disminuye y, por tanto, la cantidad de producto producido es inversamente proporcional a la concentración de moléculas inhibidoras. Dado que el bloqueo de la actividad de una enzima puede matar a un patógeno o corregir un metabolismodesequilibrio, muchos fármacos son inhibidores de enzimas. También se utilizan en plaguicidas . No todas las moléculas que se unen a las enzimas son inhibidores; los activadores enzimáticos se unen a las enzimas y aumentan su actividad enzimática , mientras que los sustratos enzimáticos se unen y se convierten en productos en el ciclo catalítico normal de la enzima.

La unión de un inhibidor puede evitar que un sustrato entre en el sitio activo de la enzima y / o impedir que la enzima catalice su reacción. La unión del inhibidor es reversible o irreversible. Los inhibidores irreversibles suelen reaccionar con la enzima y la modifican químicamente (p. Ej., Mediante la formación de enlaces covalentes ). Estos inhibidores modifican los residuos de aminoácidos clave necesarios para la actividad enzimática. Por el contrario, los inhibidores reversibles se unen de forma no covalente y se producen diferentes tipos de inhibición dependiendo de si estos inhibidores se unen a la enzima , al complejo enzima-sustrato oa ambos.

Muchas moléculas de fármacos son inhibidores de enzimas, por lo que su descubrimiento y mejora es un área activa de investigación en bioquímica y farmacología . ^[1] Un inhibidor de enzimas medicinales a menudo se juzga por su especificidad (su falta de unión a otras proteínas) y su potencia (su constante de disociación , que indica la concentración necesaria para inhibir la enzima). Una alta especificidad y potencia aseguran que un medicamento tenga pocos efectos secundarios y, por lo tanto, una baja toxicidad .

Los inhibidores de enzimas también se encuentran de forma natural y participan en la regulación del metabolismo . Por ejemplo, los productos posteriores pueden inhibir las enzimas en una ruta metabólica . Este tipo de retroalimentación negativa ralentiza la línea de producción cuando los productos comienzan a acumularse y es una forma importante de mantener la homeostasis en una célula . Otros inhibidores de enzimas celulares son proteínas que se unen e inhiben específicamente una enzima diana. Esto puede ayudar a controlar las enzimas que pueden dañar una célula, como las proteasas o nucleasas . Un ejemplo bien caracterizado de esto es el inhibidor de la ribonucleasa , que se une aribonucleasas en una de las interacciones proteína-proteína más estrechas conocidas . ^[2] Los inhibidores de enzimas naturales también pueden ser venenos y se utilizan como defensas contra los depredadores o como formas de matar presas.

Inhibidores reversibles

Tipos de inhibidores reversibles

Los inhibidores reversibles se adhieren a enzimas con interacciones no covalentes como enlaces de hidrógeno , interacciones hidrofóbicas y enlaces iónicos . Múltiples enlaces débiles entre el inhibidor y el sitio activo se combinan para producir una unión fuerte y específica. A diferencia de los sustratos y los inhibidores irreversibles, los inhibidores reversibles generalmente no experimentan reacciones químicas cuando se unen a la enzima y pueden eliminarse fácilmente mediante dilución o diálisis .

Hay cuatro tipos de inhibidores enzimáticos reversibles. Se clasifican según el efecto de variar la concentración del sustrato de la enzima sobre el inhibidor. ^{[3] [4] [5]}

Tipos de inhibición. Esta clasificación fue introducida por WW Cleland . ^[6]

• En la inhibición competitiva , el sustrato y el inhibidor no pueden unirse a la enzima al mismo tiempo, como se muestra en la figura de la derecha. Esto suele ser el resultado de que el inhibidor tiene afinidad por el sitio activo de una enzima donde el sustrato también se une; el sustrato y el inhibidor compiten por acceder al sitio activo de la enzima. Este tipo de inhibición se puede superar mediante suficientemente altas concentraciones de sustrato ( V _max permanece constante), es decir, por fuera de la competencia del inhibidor. Sin embargo, la K _m aparente aumentará a medida que se requiera una mayor concentración del sustrato para alcanzar el punto de K _m , o la mitad de la V _máx.. Los inhibidores competitivos suelen tener una estructura similar al sustrato real (véanse los ejemplos a continuación).
• En la inhibición no competitiva , el inhibidor se une solo al complejo sustrato-enzima. Este tipo de inhibición hace que V _max disminuya (la velocidad máxima disminuye como resultado de la eliminación del complejo activado) y K _m disminuye (debido a una mejor eficiencia de unión como resultado del principio de Le Chatelier y la eliminación efectiva del complejo ES disminuyendo así la K _m que indica una mayor afinidad de unión).
• En la inhibición no competitiva , la unión del inhibidor a la enzima reduce su actividad pero no afecta la unión del sustrato. Como resultado, el grado de inhibición depende solo de la concentración del inhibidor. V _max disminuirá debido a la incapacidad de que la reacción se desarrolle con la misma eficacia, pero K _m seguirá siendo la misma que la unión real del sustrato, por definición, seguirá funcionando correctamente.
• En la inhibición mixta , el inhibidor puede unirse a la enzima al mismo tiempo que el sustrato de la enzima. Sin embargo, la unión del inhibidor afecta la unión del sustrato y viceversa. Este tipo de inhibición puede reducirse, pero no superarse, aumentando las concentraciones de sustrato. Aunque es posible que los inhibidores de tipo mixto se unan al sitio activo, este tipo de inhibición generalmente resulta de un efecto alostérico en el que el inhibidor se une a un sitio diferente en una enzima. La unión del inhibidor a este sitio alostérico cambia la conformación (es decir, estructura terciaria o forma tridimensional) de la enzima de modo que se reduce la afinidad del sustrato por el sitio activo.

Estos tipos también se pueden distinguir por el efecto de aumentar la concentración de sustrato [S] sobre el grado de inhibición provocado por una determinada cantidad de inhibidor. Para la inhibición competitiva, el grado de inhibición se reduce aumentando [S], para la inhibición no competitiva el grado de inhibición no cambia y para la inhibición no competitiva (también llamada anticompetitiva) el grado de inhibición aumenta con [S]. ^[7]

Descripción cuantitativa de la inhibición reversible

La inhibición reversible se puede describir cuantitativamente en términos de la unión del inhibidor a la enzima y al complejo enzima-sustrato, y sus efectos sobre las constantes cinéticas de la enzima. En el esquema clásico de Michaelis-Menten a continuación, una enzima (E) se une a su sustrato (S) para formar el complejo enzima-sustrato ES. Tras la catálisis, este complejo se descompone para liberar el producto P y la enzima libre. El inhibidor (I) se puede unir a E o ES con la constantes de disociación K _i o K _i ', respectivamente.

Los inhibidores competitivos pueden unirse a E, pero no a ES. La inhibición competitiva aumenta K m (es decir, el inhibidor interfiere con la unión del sustrato), pero no afecta a V max (el inhibidor no obstaculiza la catálisis en ES porque no puede unirse a ES). Los inhibidores no competitivos se unen a ES. La inhibición no competitiva disminuye tanto K m 'como' V máx . El inhibidor afecta la unión del sustrato aumentando la afinidad de la enzima por el sustrato (disminuyendo K m ) así como obstaculizando la catálisis (disminuyendo V max ). Los inhibidores no competitivos tienen afinidades idénticas para E y ES ( K i = K i '). La inhibición no competitiva no cambia K m (es decir, no afecta la unión del sustrato) pero disminuye la V max (es decir, la unión del inhibidor dificulta la catálisis). Los inhibidores de tipo mixto se unen tanto a E como a ES, pero sus afinidades por estas dos formas de la enzima son diferentes ( K i ≠ K i '). Por tanto, los inhibidores de tipo mixto afectan la unión del sustrato (aumentan o disminuyen K m ) y obstaculizan la catálisis en el complejo ES (disminuyen V max ).

Esquema cinético para inhibidores enzimáticos reversibles

Cuando una enzima tiene múltiples sustratos, los inhibidores pueden mostrar diferentes tipos de inhibición dependiendo de qué sustrato se considere. Esto resulta de que el sitio activo contiene dos sitios de unión diferentes dentro del sitio activo, uno para cada sustrato. Por ejemplo, un inhibidor podría competir con el sustrato A por el primer sitio de unión, pero ser un inhibidor no competitivo con respecto al sustrato B en el segundo sitio de unión. ^[8]

Medición de las constantes de disociación de un inhibidor reversible

Como se señaló anteriormente, un inhibidor de enzima se caracteriza por sus dos constantes de disociación , K _i y K _i ', a la enzima y al complejo enzima-sustrato, respectivamente. La constante de enzima-inhibidor K _i se puede medir directamente por varios métodos; Un método extremadamente preciso es la calorimetría de titulación isotérmica , en la que el inhibidor se titula en una solución de enzima y se mide el calor liberado o absorbido. ^[9] Sin embargo, la otra constante de disociación K _i 'es difícil de medir directamente, ya que el complejo enzima-sustrato es de corta duración y de someterse a una reacción química para formar el producto. Por eso,K _i 'se mide generalmente indirectamente, mediante la observación de la actividad de la enzima bajo diversas concentraciones de sustrato y de inhibidor, y ajuste de los datos ^[10] a un modificado ecuación de Michaelis-Menten

${\displaystyle V={\frac {V_{max}[S]}{\alpha K_{m}+\alpha ^{\prime }[S]}}={\frac {(1/\alpha ^{\prime })V_{max}[S]}{(\alpha /\alpha ^{\prime })K_{m}+[S]}}}$

donde los factores modificadores α y α 'están definidos por la concentración de inhibidor y sus dos constantes de disociación

${\displaystyle \alpha =1+{\frac {[I]}{K_{i}}}}$

${\displaystyle \alpha ^{\prime }=1+{\frac {[I]}{K_{i}^{\prime }}}.}$

Por tanto, en presencia del inhibidor, las K _m y V _max efectivas de la enzima se convierten en (α / α ') K _m y (1 / α') V _max , respectivamente. Sin embargo, la ecuación de Michaelis-Menten modificada asume que la unión del inhibidor a la enzima ha alcanzado el equilibrio, lo que puede ser un proceso muy lento para los inhibidores con constantes de disociación sub-nanomolares. En estos casos, suele ser más práctico tratar el inhibidor de unión fuerte como un inhibidor irreversible (ver más adelante); sin embargo, todavía puede ser posible estimar K _i 'cinéticamente si K _i se mide de forma independiente.

Los efectos de diferentes tipos de inhibidores enzimáticos reversibles sobre la actividad enzimática se pueden visualizar mediante representaciones gráficas de la ecuación de Michaelis-Menten, como los gráficos de Lineweaver-Burk , los gráficos de Eadie-Hofstee o los gráficos de Hanes-Woolf . Por ejemplo, en los gráficos de Lineweaver-Burk de la derecha, las líneas de inhibición competitiva se cruzan en el eje y , lo que ilustra que dichos inhibidores no afectan a V _max . De manera similar, las líneas de inhibición no competitivas se cruzan en el eje x , lo que muestra que estos inhibidores no afectan a K _m . Sin embargo, puede ser difícil estimar K _i y K_i 'con precisión a partir de tales gráficos, ^[11] por lo que es aconsejable estimar estas constantes utilizando métodos de regresión no lineal más confiables , como se describió anteriormente.

Inhibidores reversibles

Los inhibidores de enzimas tradicionalmente reversibles se han clasificado como competitivos, no competitivos o no competitivos, según sus efectos sobre K _m y V _max.. Estos diferentes efectos resultan de la unión del inhibidor a la enzima E, al complejo enzima-sustrato ES, oa ambos, respectivamente. La división de estas clases surge de un problema en su derivación y da como resultado la necesidad de usar dos constantes de enlace diferentes para un evento de enlace. La unión de un inhibidor y su efecto sobre la actividad enzimática son dos cosas claramente diferentes, otro problema que las ecuaciones tradicionales no reconocen. En la inhibición no competitiva, la unión del inhibidor da como resultado una inhibición del 100% de la enzima únicamente y no considera la posibilidad de algo intermedio. ^[12]La forma común del término inhibidor también oculta la relación entre la unión del inhibidor a la enzima y su relación con cualquier otro término de unión, ya sea la ecuación de Michaelis-Menten o una curva de respuesta a la dosis asociada con la unión al receptor del ligando. Para demostrar la relación, se puede realizar la siguiente reordenación:

${\displaystyle {\begin{aligned}{\cfrac {V_{\max }}{1+{\cfrac {\ce {[I]}}{K_{i}}}}}&={V_{\max }}\left({\cfrac {K_{i}}{K_{i}+[{\ce {I}}]}}\right)&&{\text{multiply by }}{\cfrac {K_{i}}{K_{i}}}=1\\&={V_{\max }}\left({\cfrac {K_{i}+[{\ce {I}}]-[{\ce {I}}]}{K_{i}+[{\ce {I}}]}}\right)&&{\text{add }}[{\ce {I}}]-[{\ce {I}}]=0{\text{ to numerator}}\\&={V_{\max }}\left(1-{\cfrac {[{\ce {I}}]}{K_{i}+[{\ce {I}}]}}\right)&&{\text{simplify }}{\cfrac {K_{i}+[{\ce {I}}]}{K_{i}+[{\ce {I}}]}}=1\\&=V_{\max }-V_{\max }{\cfrac {\ce {[I]}}{K_{i}+[{\ce {I}}]}}&&{\text{multiply out by }}V_{\max }\end{aligned}}}$

Este reordenamiento demuestra que, similar a la ecuación de Michaelis-Menten, la velocidad máxima de reacción depende de la proporción de la población de enzimas que interactúa con su sustrato.

fracción de la población de enzimas unida al sustrato

${\displaystyle {\cfrac {\ce {[S]}}{[{\ce {S}}]+K_{m}}}}$

fracción de la población de enzimas unida por inhibidor

${\displaystyle {\cfrac {\ce {[I]}}{[{\ce {I}}]+K_{i}}}}$

el efecto del inhibidor es el resultado del porcentaje de la población de enzimas que interactúa con el inhibidor. El único problema con esta ecuación en su forma actual es que supone una inhibición absoluta de la enzima con la unión del inhibidor, cuando de hecho puede haber una amplia gama de efectos desde el 100% de inhibición de la rotación del sustrato hasta apenas> 0%. Para tener en cuenta esto, la ecuación se puede modificar fácilmente para permitir diferentes grados de inhibición al incluir un término delta V _máx .

${\displaystyle V_{\max }-\Delta V_{\max }{\cfrac {\ce {[I]}}{[{\ce {I}}]+K_{i}}}}$

o

${\displaystyle V_{\max 1}-(V_{\max 1}-V_{\max 2}){\cfrac {\ce {[I]}}{[{\ce {I}}]+K_{i}}}}$

Este término puede entonces definir la actividad enzimática residual presente cuando el inhibidor interactúa con enzimas individuales en la población. Sin embargo, la inclusión de este término tiene el valor agregado de permitir la posibilidad de activación si el término secundario V _max resulta ser mayor que el término inicial. Para tener en cuenta también la posibilidad de activación, la notación se puede reescribir reemplazando el inhibidor "I" con un término modificador denotado aquí como "X".

${\displaystyle V_{\max 1}-(V_{\max 1}-V_{\max 2}){\cfrac {\ce {[X]}}{[{\ce {X}}]+K_{x}}}}$

Si bien esta terminología da como resultado una forma simplificada de tratar los efectos cinéticos relacionados con la velocidad máxima de la ecuación de Michaelis-Menten, resalta los problemas potenciales con el término utilizado para describir los efectos relacionados con la K _m . La K _m relacionada con la afinidad de la enzima por el sustrato debería, en la mayoría de los casos, estar relacionada con cambios potenciales en el sitio de unión de la enzima que resultarían directamente de las interacciones del inhibidor de la enzima. Como tal, un término similar al propuesto anteriormente para modular V _max debería ser apropiado en la mayoría de las situaciones: ^[13]

${\displaystyle K_{m1}-(K_{m1}-K_{m2}){\cfrac {\ce {[X]}}{[{\ce {X}}]+K_{x}}}}$

Casos especiales

• El mecanismo de inhibición parcialmente competitiva es similar al de la no competitiva, excepto que el complejo EIS tiene actividad catalítica, que puede ser menor o incluso mayor (activación parcialmente competitiva) que la del complejo enzima-sustrato (ES). Esta inhibición normalmente muestra un V _{max más bajo} , pero un valor de K _m no afectado . ^[14]
• La inhibición no competitiva ocurre cuando el inhibidor se une solo al complejo enzima-sustrato, no a la enzima libre; el complejo EIS es catalíticamente inactivo. Este modo de inhibición es poco común y causa una disminución tanto en el valor de V _max como en el de K _m . ^[14]
• La inhibición del sustrato y del producto es cuando el sustrato o el producto de una reacción enzimática inhiben la actividad de la enzima. Esta inhibición puede seguir patrones competitivos, no competitivos o mixtos. En la inhibición del sustrato hay una disminución progresiva de la actividad a concentraciones elevadas de sustrato. Esto puede indicar la existencia de dos sitios de unión al sustrato en la enzima. ^[15] Con un sustrato bajo, el sitio de alta afinidad está ocupado y se sigue la cinética normal . Sin embargo, a concentraciones más altas, el segundo sitio inhibidor se ocupa, inhibiendo la enzima. ^[16] La inhibición del producto es a menudo una característica reguladora del metabolismo y puede ser una forma de retroalimentación negativa .
• La inhibición lenta se produce cuando el complejo enzima-inhibidor inicial EI sufre isomerización a un segundo complejo más apretado, EI *, pero el proceso de inhibición general es reversible. Esto se manifiesta como una inhibición enzimática que aumenta lentamente. En estas condiciones, la cinética de Michaelis-Menten tradicionales dan un valor falso para K _i , que es dependiente del tiempo. ^[17] El verdadero valor de K _i puede obtener mediante análisis más complejo de la en ( k _sobre ) y desactivación ( k _off ) constantes de velocidad de asociación inhibidor. Consulte la inhibición irreversible a continuación para obtener más información.

Inhibidor de la proteasa del VIH-1 basado en péptidos ritonavir

No peptídicos de VIH-1 inhibidor de la proteasa tipranavir

• Los inhibidores de análogos bi-sustrato son inhibidores de alta afinidad y selectividad que se pueden preparar para enzimas que catalizan reacciones bi-moleculares al capturar la energía de unión de cada sustrato en una molécula. ^{[18] [19]} Por ejemplo, en las reacciones de transferencia de formilo de la biosíntesis de purina, se preparó sintéticamente un potente inhibidor de aductos de múltiples sustratos (MAI) para GAR TFasa mediante la unión de análogos del sustrato de ribonucleótido de glicinamida (GAR) y el N-10 -cofactor de tetrahidrofolato de formilo junto para producir dideazafolato de ribonucleótido de tioglicinamida (TGDDF), ^[20] o enzimáticamente a partir del sustrato GAR natural para producir GDDF. ^[21]Aquí, la constante de disociación subnanomolar (KD) de TGDDF fue mayor de lo previsto, presumiblemente debido a las ventajas entrópicas obtenidas y / o las interacciones positivas adquiridas a través de los átomos que unen los componentes. También se ha observado que los MAI se producen en las células por reacciones de profármacos como isoniazida ^[22] o ligandos inhibidores de enzimas (p. Ej., PTC124 ) ^[23] con cofactores celulares como NADH y ATP, respectivamente.

Ejemplos de inhibidores reversibles

Dado que las enzimas han evolucionado para unir sus sustratos de manera firme, y la mayoría de los inhibidores reversibles se unen en el sitio activo de las enzimas, no es sorprendente que algunos de estos inhibidores sean sorprendentemente similares en estructura a los sustratos de sus objetivos. Los inhibidores de DHFR son ejemplos destacados. Otro ejemplo de estos imitadores de sustrato son los inhibidores de proteasa , una clase muy exitosa de medicamentos antirretrovirales utilizados para tratar el VIH . ^[24] La estructura de ritonavir , un inhibidor de proteasa basado en un péptido y que contiene tres enlaces peptídicos., se muestra a la derecha. Como este fármaco se parece a la proteína que es el sustrato de la proteasa del VIH, compite con este sustrato en el sitio activo de la enzima.

Los inhibidores de enzimas se diseñan a menudo para imitar el estado de transición o intermedio de una reacción catalizada por enzimas. Esto asegura que el inhibidor explota el estado de transición efecto de la enzima de estabilización, resultando en una mejor afinidad de unión (Baja K _i ) que los diseños basados en sustrato. Un ejemplo de tal inhibidor del estado de transición es el fármaco antivírico oseltamivir ; este fármaco imita la naturaleza plana del ión oxonio del anillo en la reacción de la enzima viral neuraminidasa . ^[25]

Sin embargo, no todos los inhibidores se basan en las estructuras de los sustratos. Por ejemplo, la estructura de otro inhibidor de la proteasa del VIH, tipranavir, se muestra a la izquierda. Esta molécula no se basa en un péptido y no tiene una similitud estructural obvia con un sustrato proteico. Estos inhibidores no peptídicos pueden ser más estables que los inhibidores que contienen enlaces peptídicos, porque no serán sustratos para las peptidasas y es menos probable que se degraden. ^[26]

En el diseño de fármacos, es importante considerar las concentraciones de sustratos a los que están expuestas las enzimas diana. Por ejemplo, algunos inhibidores de la proteína quinasa tienen estructuras químicas que son similares al trifosfato de adenosina., uno de los sustratos de estas enzimas. Sin embargo, los fármacos que son simples inhibidores competitivos tendrán que competir con las altas concentraciones de ATP en la célula. Las proteínas quinasas también pueden inhibirse por competencia en los sitios de unión donde las quinasas interactúan con sus proteínas sustrato, y la mayoría de las proteínas están presentes dentro de las células en concentraciones mucho más bajas que la concentración de ATP. Como consecuencia, si dos inhibidores de la proteína quinasa se unen en el sitio activo con una afinidad similar, pero solo uno tiene que competir con el ATP, entonces el inhibidor competitivo en el sitio de unión a la proteína inhibirá la enzima de manera más eficaz. ^[27]

Inhibidores irreversibles

Tipos de inhibición irreversible (inactivación covalente)

Reacción del inhibidor irreversible diisopropilfluorofosfato (DFP) con una serina proteasa

Los inhibidores irreversibles suelen modificar covalentemente una enzima y, por tanto, la inhibición no puede revertirse. Los inhibidores irreversibles a menudo contienen grupos funcionales reactivos como mostazas de nitrógeno , aldehídos , haloalcanos , alquenos , aceptores de Michael , fenilsulfonatos o fluorofosfonatos . Estos grupos nucleofílicos reaccionan con las cadenas laterales de aminoácidos para formar aductos covalentes . Los residuos modificados son aquellos con cadenas laterales que contienen nucleófilos como hidroxilo o sulfhidrilo.grupos; estos incluyen los aminoácidos serina (como en DFP , derecha), cisteína , treonina o tirosina . ^[28]

La inhibición irreversible es diferente de la inactivación enzimática irreversible. Los inhibidores irreversibles son generalmente específicos para una clase de enzima y no inactivan todas las proteínas; no funcionan destruyendo la estructura de las proteínas, sino alterando específicamente el sitio activo de su objetivo. Por ejemplo, los extremos de pH o temperatura suelen provocar la desnaturalización de toda la estructura de la proteína , pero este es un efecto no específico. De manera similar, algunos tratamientos químicos no específicos destruyen la estructura de las proteínas: por ejemplo, el calentamiento en ácido clorhídrico concentrado hidrolizará los enlaces peptídicos que mantienen unidas las proteínas, liberando aminoácidos libres. ^[29]

Los inhibidores irreversibles muestran la inhibición dependiente del tiempo y su potencia por lo tanto no pueden ser caracterizados por un IC ₅₀ valor. ^{[30] [31]} Esto se debe a que la cantidad de enzima activa a una concentración determinada de inhibidor irreversible será diferente según el tiempo que el inhibidor esté preincubado con la enzima. En su lugar, se utilizan valores de k _obs / [ I ], ^[32] donde k _obs es la tasa de inactivación de pseudoprimer orden observada (obtenida trazando el logaritmo del% de actividad frente al tiempo) y [ I ] es la concentración de inhibidor . El k _obs / [ I] El parámetro es válido siempre que el inhibidor no sature la unión con la enzima (en cuyo caso k _obs = k _inact ).

Análisis de inhibición irreversible

Esquema cinético para inhibidores irreversibles.

Como se muestra en la figura de la derecha, los inhibidores irreversibles tienen una instancia corta en la que forman un complejo no covalente reversible con la enzima (EI o ESI) y esta luego reacciona para producir el "complejo sin salida" EI * modificado covalentemente ( un complejo covalente irreversible). La velocidad a la que se forma EI * se denomina velocidad de inactivación o k _inact . Dado que la formación de EI puede competir con ES, la unión de inhibidores irreversibles se puede prevenir mediante la competencia con el sustrato o con un segundo inhibidor reversible. Este efecto de protección es una buena evidencia de una reacción específica del inhibidor irreversible con el sitio activo.

Las etapas de unión e inactivación de esta reacción se investigan incubando la enzima con inhibidor y analizando la cantidad de actividad restante a lo largo del tiempo. La actividad se reducirá de manera dependiente del tiempo, generalmente después de una disminución exponencial . Al ajustar estos datos a una ecuación de velocidad, se obtiene la velocidad de inactivación a esta concentración de inhibidor. Esto se hace a diferentes concentraciones de inhibidor. Si un complejo EI reversible está implicada la tasa de inactivación será saturable y ajustando esta curva dará k _inact y K _i . ^[33]

Otro método que se usa ampliamente en estos análisis es la espectrometría de masas . Aquí, la medición precisa de la masa de la enzima nativa no modificada y la enzima inactivada da el aumento de masa causado por la reacción con el inhibidor y muestra la estequiometría de la reacción. ^[34] Esto generalmente se hace usando un espectrómetro de masas MALDI-TOF . En una técnica complementaria, la huella de péptidos en masa implica la digestión de la proteína nativa y modificada con una proteasa como la tripsina . Esto producirá un conjunto de péptidos.que se puede analizar con un espectrómetro de masas. El péptido que cambia de masa después de la reacción con el inhibidor será el que contenga el sitio de modificación.

Casos especiales

Mecanismo químico para la inhibición irreversible de la ornitina descarboxilasa por DFMO. No se muestran el piridoxal 5'-fosfato (Py) y la enzima (E). Adaptado de ^[35]

No todos los inhibidores irreversibles forman aductos covalentes con sus objetivos enzimáticos. Algunos inhibidores reversibles se unen con tanta fuerza a su enzima objetivo que son esencialmente irreversibles. Estos inhibidores de unión fuerte pueden mostrar una cinética similar a la de los inhibidores covalentes irreversibles. En estos casos, algunos de estos inhibidores se unen rápidamente a la enzima en un complejo EI de baja afinidad y luego experimenta una reordenación más lenta a un complejo EI * muy unido (ver figura anterior). Este comportamiento cinético se denomina unión lenta. ^[36] Este reordenamiento lento después de la unión a menudo implica un cambio conformacional a medida que la enzima "se aprieta" alrededor de la molécula inhibidora. Los ejemplos de inhibidores de unión lenta incluyen algunos medicamentos importantes, como el metotrexato , ^[37] alopurinol , ^[38] y la forma activada de aciclovir . ^[39]

Ejemplos de inhibidores irreversibles

La tripanotiona reductasa con la molécula inferior de un inhibidor unida de forma irreversible y la superior de forma reversible. Creado a partir de PDB 1GXF .

El diisopropilfluorofosfato (DFP) se muestra como un ejemplo de un inhibidor de proteasa irreversible en la figura de arriba a la derecha . La enzima hidroliza el enlace fósforo-flúor, pero el residuo de fosfato permanece unido a la serina en el sitio activo , desactivándolo. ^[40] De manera similar, la DFP también reacciona con el sitio activo de la acetilcolina esterasa en las sinapsis de las neuronas y, en consecuencia, es una neurotoxina potente, con una dosis letal de menos de 100 mg. ^[41]

La inhibición del suicidio es un tipo inusual de inhibición irreversible en la que la enzima convierte el inhibidor en una forma reactiva en su sitio activo. Un ejemplo es el inhibidor de la biosíntesis de poliaminas , α-difluorometilornitina o DFMO, que es un análogo del aminoácido ornitina y se usa para tratar la tripanosomiasis africana (enfermedad del sueño). La descarboxilasa de ornitina puede catalizar la descarboxilación de DFMO en lugar de ornitina, como se muestra arriba. Sin embargo, a esta reacción de descarboxilación le sigue la eliminación de un átomo de flúor, que convierte este intermedio catalítico en una imina conjugada., una especie altamente electrofílica. Esta forma reactiva de DFMO luego reacciona con un residuo de cisteína o lisina en el sitio activo para inactivar irreversiblemente la enzima. ^[35]

Dado que la inhibición irreversible a menudo implica la formación inicial de un complejo EI no covalente, a veces es posible que un inhibidor se una a una enzima de más de una forma. Por ejemplo, en la figura que muestra la tripanotiona reductasa del parásito protozoario humano Trypanosoma cruzi , dos moléculas de un inhibidor llamado mostaza quinacrina están unidas en su sitio activo. La molécula superior está unida reversiblemente, pero la inferior está unida covalentemente ya que ha reaccionado con un residuo de aminoácido a través de su grupo mostaza nitrogenada . ^[42]

Descubrimiento y diseño de inhibidores

Robots utilizados para el cribado de alto rendimiento de bibliotecas químicas para descubrir nuevos inhibidores de enzimas.

Los nuevos fármacos son el producto de un largo proceso de desarrollo de fármacos , cuyo primer paso suele ser el descubrimiento de un nuevo inhibidor enzimático. En el pasado, la única forma de descubrir estos nuevos inhibidores era mediante prueba y error: examinando enormes bibliotecas de compuestos contra una enzima objetivo y esperando que surgieran algunas pistas útiles. Este enfoque de fuerza bruta todavía es exitoso e incluso se ha extendido mediante enfoques de química combinatoria que producen rápidamente una gran cantidad de compuestos nuevos y tecnología de detección de alto rendimiento para detectar rápidamente estas enormes bibliotecas químicas en busca de inhibidores útiles. ^[43]

Más recientemente, se ha aplicado un enfoque alternativo: el diseño racional de fármacos utiliza la estructura tridimensional del sitio activo de una enzima para predecir qué moléculas podrían ser inhibidoras. ^[44] Estas predicciones se prueban luego y uno de estos compuestos probados puede ser un inhibidor nuevo. Este nuevo inhibidor se usa luego para tratar de obtener una estructura de la enzima en un complejo inhibidor / enzima para mostrar cómo la molécula se une al sitio activo, permitiendo que se realicen cambios en el inhibidor para tratar de optimizar la unión. Este ciclo de prueba y mejora se repite luego hasta que se produce un inhibidor suficientemente potente. ^[45] Métodos informáticosde predecir la afinidad de un inhibidor por una enzima también se están desarrollando, como el acoplamiento molecular ^[46] y la mecánica molecular .

Usos de inhibidores

Los inhibidores de enzimas se encuentran en la naturaleza y también se diseñan y producen como parte de la farmacología y la bioquímica . Los venenos naturales son a menudo inhibidores de enzimas que han evolucionado para defender a una planta o un animal de los depredadores . Estas toxinas naturales incluyen algunos de los compuestos más venenosos conocidos. Los inhibidores artificiales se utilizan a menudo como fármacos, pero también pueden ser insecticidas como el malatión , herbicidas como el glifosato o desinfectantes como el triclosán . Otros inhibidores de enzimas artificiales bloquean la acetilcolinesterasa , una enzima que descomponeacetilcolina , y se utilizan como agentes nerviosos en la guerra química .

Quimioterapia

La estructura del sildenafil (Viagra)

La coenzima ácido fólico (izquierda) en comparación con el fármaco anticanceroso metotrexato (derecha)

La estructura de un complejo entre la penicilina G y la transpeptidasa de Streptomyces . Generado a partir de PDB 1PWC .

Los usos más comunes de los inhibidores de enzimas son como medicamentos para tratar enfermedades. Muchos de estos inhibidores se dirigen a una enzima humana y tienen como objetivo corregir una condición patológica. Sin embargo, no todos los medicamentos son inhibidores de enzimas. Algunos, como los fármacos antiepilépticos , alteran la actividad enzimática al hacer que se produzca más o menos enzima. Estos efectos se denominan inducción e inhibición enzimática y son alteraciones en la expresión génica , que no está relacionada con el tipo de inhibición enzimática que se analiza aquí. Otros fármacos interactúan con dianas celulares que no son enzimas, como los canales iónicos o los receptores de membrana .

Un ejemplo de inhibidor de enzimas medicinales es el sildenafil (Viagra), un tratamiento común para la disfunción eréctil masculina. Este compuesto es un potente inhibidor de la fosfodiesterasa tipo 5 específica de cGMP , la enzima que degrada la molécula de señalización monofosfato de guanosina cíclico . ^[47] Esta molécula de señalización desencadena la relajación del músculo liso y permite que la sangre fluya hacia el cuerpo cavernoso , lo que provoca una erección. Dado que el fármaco reduce la actividad de la enzima que detiene la señal, hace que esta señal dure más tiempo.

Otro ejemplo de la similitud estructural de algunos inhibidores con los sustratos de las enzimas a las que se dirigen se ve en la figura que compara el fármaco metotrexato con el ácido fólico . El ácido fólico es un sustrato de la dihidrofolato reductasa , una enzima involucrada en la producción de nucleótidos que es inhibida de manera potente por el metotrexato. El metotrexato bloquea la acción de la dihidrofolato reductasa y, por lo tanto, detiene la producción de nucleótidos. Este bloque de biosíntesis de nucleótidos es más tóxico para las células de crecimiento rápido que las células que no se dividen, ya que una célula de crecimiento rápido tiene que realizar la replicación del ADN , por lo que el metotrexato se utiliza a menudo en la quimioterapia del cáncer . ^[48]

Antibióticos

Los fármacos también se utilizan para inhibir las enzimas necesarias para la supervivencia de patógenos . Por ejemplo, las bacterias están rodeadas por una pared celular gruesa hecha de un polímero en forma de red llamado peptidoglicano . Muchos antibióticos como la penicilina y la vancomicina inhiben las enzimas que producen y luego entrecruzan las hebras de este polímero. ^[49] Esto hace que la pared celular pierda fuerza y ​​las bacterias exploten. En la figura, se muestra una molécula de penicilina (mostrada en forma de bola y palo) unida a su objetivo, la transpeptidasa de la bacteria Streptomyces R61 (la proteína se muestra como un diagrama de cinta ).

El diseño de fármacos antibióticos se facilita cuando una enzima que es esencial para la supervivencia del patógeno está ausente o es muy diferente en los seres humanos. En el ejemplo anterior, los seres humanos no producen peptidoglicano, por lo que los inhibidores de este proceso son selectivamente tóxicos para las bacterias. La toxicidad selectiva también se produce en los antibióticos al explotar las diferencias en la estructura de los ribosomas en las bacterias o en cómo producen los ácidos grasos .

Control metabólico

Los inhibidores de enzimas también son importantes en el control metabólico. Muchas vías metabólicas en la célula son inhibidas por metabolitos que controlan la actividad enzimática a través de la regulación alostérica o la inhibición del sustrato. Un buen ejemplo es la regulación alostérica de la vía glucolítica . Esta vía catabólica consume glucosa y produce ATP , NADH y piruvato . Un paso clave para la regulación de la glucólisis es una reacción temprana en la vía catalizada por la fosfofructoquinasa-1.(PFK1). Cuando los niveles de ATP aumentan, el ATP se une a un sitio alostérico en PFK1 para disminuir la velocidad de la reacción enzimática; se inhibe la glucólisis y disminuye la producción de ATP. Este control de retroalimentación negativa ayuda a mantener una concentración constante de ATP en la célula. Sin embargo, las vías metabólicas no solo se regulan mediante inhibición, ya que la activación enzimática es igualmente importante. Con respecto a PFK1, la fructosa 2,6-bisfosfato y ADP son ejemplos de metabolitos que son activadores alostéricos. ^[50]

La inhibición fisiológica de enzimas también puede producirse mediante inhibidores de proteínas específicos. Este mecanismo ocurre en el páncreas , que sintetiza muchas enzimas precursoras digestivas conocidas como zimógenos . Muchos de estos son activados por la tripsina proteasa, por lo que es importante inhibir la actividad de la tripsina en el páncreas para evitar que el órgano se digiera a sí mismo. Una forma de controlar la actividad de la tripsina es la producción de una proteína inhibidora de tripsina específica y potente en el páncreas. Este inhibidor se une fuertemente a la tripsina, previniendo la actividad de la tripsina que de otro modo sería perjudicial para el órgano. ^[51]Aunque el inhibidor de tripsina es una proteína, evita ser hidrolizado como sustrato por la proteasa al excluir el agua del sitio activo de la tripsina y desestabilizar el estado de transición. ^[52] Otros ejemplos de proteínas inhibidoras de enzimas fisiológicas incluyen el inhibidor barstar de la ribonucleasa barnasa bacteriana . ^[53]

Plaguicidas

Muchos pesticidas son inhibidores de enzimas. La acetilcolinesterasa (AChE) es una enzima que se encuentra en los animales, desde los insectos hasta los humanos. Es esencial para el funcionamiento de las células nerviosas a través de su mecanismo de descomposición del neurotransmisor acetilcolina en sus componentes, acetato y colina . Esto es algo inusual entre los neurotransmisores, ya que la mayoría, incluidas la serotonina , la dopamina y la noradrenalina , se absorben de la hendidura sináptica en lugar de escindirse. Una gran cantidad de inhibidores de AChE se utilizan tanto en medicina como en agricultura. Inhibidores competitivos reversibles, como edrofonio ,La fisostigmina y la neostigmina se utilizan en el tratamiento de la miastenia gravis y en la anestesia. Los plaguicidas de carbamato también son ejemplos de inhibidores de AChE reversibles. Los pesticidas organofosforados como el malatión , el paratión y el clorpirifos inhiben irreversiblemente la acetilcolinesterasa.

El herbicida glifosato es un inhibidor de la 3-fosfoshikimato 1-carboxiviniltransferasa , ^[54] otros herbicidas, como las sulfonilureas, inhiben la enzima acetolactato sintasa . Ambas enzimas son necesarias para que las plantas produzcan aminoácidos de cadena ramificada . Muchas otras enzimas son inhibidas por herbicidas, incluidas las enzimas necesarias para la biosíntesis de lípidos y carotenoides y los procesos de fotosíntesis y fosforilación oxidativa . ^[55]

Venenos naturales

Para disuadir a los depredadores de semillas , las legumbres contienen inhibidores de tripsina que interfieren con la digestión.

Los animales y las plantas han evolucionado para sintetizar una amplia gama de productos venenosos, incluidos metabolitos secundarios , péptidos y proteínas que pueden actuar como inhibidores. Las toxinas naturales suelen ser pequeñas moléculas orgánicas y son tan diversas que probablemente existan inhibidores naturales para la mayoría de los procesos metabólicos. ^[56] Los procesos metabólicos a los que se dirigen los venenos naturales abarcan más que las enzimas en las vías metabólicas y también pueden incluir la inhibición de las funciones de los receptores, los canales y las proteínas estructurales en una célula. Por ejemplo, el paclitaxel (taxol), una molécula orgánica que se encuentra en el tejo del Pacífico , se une fuertemente a los dímeros de tubulina e inhibe su ensamblaje en microtúbulos.en el citoesqueleto . ^[57]

Muchos venenos naturales actúan como neurotoxinas que pueden causar parálisis que conducen a la muerte y tienen funciones de defensa contra depredadores o en la caza y captura de presas. Algunos de estos inhibidores naturales, a pesar de sus atributos tóxicos, son valiosos para usos terapéuticos en dosis más bajas. ^[58] Un ejemplo de neurotoxina son los glicoalcaloides , de la especie vegetal de la familia de las solanáceas (que incluye la patata , el tomate y la berenjena ), que son la acetilcolinesterasa.inhibidores. La inhibición de esta enzima provoca un aumento incontrolado del neurotransmisor acetilcolina, parálisis muscular y luego la muerte. La neurotoxicidad también puede resultar de la inhibición de receptores; por ejemplo, atropina de la solanácea mortal ( Atropa belladonna ) que funciona como un antagonista competitivo de los receptores muscarínicos de acetilcolina . ^[59]

Aunque muchas toxinas naturales son metabolitos secundarios, estos venenos también incluyen péptidos y proteínas. Un ejemplo de péptido tóxico es la alfa-amanitina , que se encuentra en parientes del hongo del sombrero de la muerte . Este es un potente inhibidor de la enzima, que en este caso evita que la enzima ARN polimerasa II transcriba el ADN. ^[60] La microcistina de la toxina de las algas también es un péptido y es un inhibidor de las proteínas fosfatasas . ^[61] Esta toxina puede contaminar los suministros de agua después de la proliferación de algas y es un carcinógeno conocido que también puede causar hemorragia hepática aguda y muerte en dosis más altas. ^[62]

Las proteínas también pueden ser venenos naturales o antinutrientes , como los inhibidores de tripsina (discutidos anteriormente) que se encuentran en algunas legumbres , como se muestra en la figura anterior. Una clase menos común de toxinas son las enzimas tóxicas: estas actúan como inhibidores irreversibles de sus enzimas diana y funcionan modificando químicamente sus enzimas sustrato. Un ejemplo es la ricina , una toxina proteica extremadamente potente que se encuentra en las semillas de aceite de ricino . Esta enzima es una glicosidasa que inactiva los ribosomas. Dado que la ricina es un inhibidor catalítico irreversible, esto permite que una sola molécula de ricina mate una célula. ^[63]

Ver también

• Proteómica basada en la actividad : una rama de la proteómica que utiliza inhibidores de enzimas covalentes como indicadores para controlar la actividad de las enzimas.
• Antimetabolito
• Farmacóforo
• Estado de transición analógico

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Enlaces externos

• Tutorial web sobre inhibición de enzimas , tutorial del Dr. Peter Birch de la Universidad de Paisley, que contiene animaciones muy claras
• Simbolismo y terminología en cinética enzimática , recomendaciones del Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica (NC-IUB) sobre terminología de inhibición enzimática
• PubChem de NCBI , base de datos de fármacos e inhibidores de enzimas
• BRENDA , base de datos de enzimas con listas de inhibidores conocidos para cada entrada
• Enzimas, cinética y uso diagnóstico , conferencia en línea que se concentra en las aplicaciones médicas de los inhibidores de enzimas: por el Dr. Michael W. King de la Facultad de Medicina de IU
• BindingDB , una base de datos pública de afinidades de unión proteína-ligando medidas.
• Ejercicio animado de inhibición de enzimas (tutorial + cuestionarios).